HB-EGF对大鼠肠道淤血再灌注及肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究

摘要

在肝脏外科，为减少手术过程中的出血常需阻断第一肝门，这势必造成肝脏缺血和肠道淤血，而随后的肝门开放，则不可避免地造成肝脏的缺血再灌注损伤及肠道的淤血再灌注损伤。在肝脏移植领域，也不可避免地会涉及到这些损伤。如何有效地减轻这些损伤，一直是国内外学者研究的热点。　　 肝素结合表皮生长因子样生长因子(Heparin-binding epidermal growthfactor-like growth factor，HB-EGF)作为一种细胞保护因子对组织器官起保护作用，近年来越来越受到关注。HB-EGF是表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)家族中的一员。后来的研究表明，HB-EGF基因广泛表达，HB-EGF可减少氧自由基的产生，并对多种细胞具有促有丝分裂的作用。　　 HB-EGF可以减轻大鼠肠道缺血再灌注损伤时的细菌移位和炎症因子的表达，可增加坏死性肠炎时肠道微血管血流量，改善失血性休克后肠道的微循环。肝脏方面，HB-EGF在大鼠肝脏部分切除后可通过旁分泌的方式促进肝脏的再生，转基因小鼠模型实验也证实该因子可以促进肝切除术后的肝脏再生。有研究认为HB-EGF对肝细胞的保护和促有丝分裂能力比肝细胞生长因子更强。大鼠肠道发生缺血再灌注损伤时，肠管内注射HB-EGF对肺也起到保护作用。　　 HB-EGF对肠道缺血再灌注损伤保护作用的动物实验研究多是通过阻断肠系膜上动脉血供的方法进行，但HB-EGF对肝门阻断后肠道淤血损伤的保护作用尚未见报道。研究表明，淤血性损伤较缺血性损伤更为严重、损伤恢复更为缓慢。淤血与缺血存在不同之处，因此淤血再灌注损伤过程与缺血再灌注损伤亦有不同。　　 针对肝脏缺血再灌注损伤及肠道淤血再灌注损伤这一常见的临床问题，并鉴于HB-EGF对肠系膜上动脉阻断所致的肠道缺血再灌注损伤有比较确切的保护作用，而目前尚未见HB-EGF对肠道淤血再灌注损伤保护作用的研究，其对肝脏缺血再灌注损伤有无保护作用也未见报道，我们设计动物实验进行相关的研究。我们采用Pringle's法建立第一肝门阻断的大鼠模型，观察HB-EGF是否可以减轻肠道的淤血再灌注损伤。更进一步的研究，我们模拟肝脏移植手术，建立经门静脉灌注的大鼠自体肝脏移植模型，观察HB-EGF对肝脏缺血再灌注损伤是否也起保护作用，并从炎症反应的角度对HB-EGF保护肝脏的机制进行初步探讨。　　 第一章:HB-EGF对大鼠肠道淤血再灌注损伤保护作用的研究　　 目的:　　 探讨HB-EGF是否对第一肝门阻断所造成的大鼠肠道淤血再灌注损伤起保护作用。　　 材料和方法:　　 1.实验动物和材料　　 雄性Sprague-Dawley大鼠，样本量为30只，周龄7～9周，体重213-256 g。清洁级，饲养条件符合SPF级标准，购自南方医科大学实验动物中心。HB-EGF购自美国R&D Systems公司。　　 2.动物模型的建立　　 大鼠术前禁食12小时，不禁水。采用乙醚吸入麻醉，备皮消毒后取腹部正中纵行切口入腹。显露第一肝门，Pringle's法阻断第一肝门，30分钟后去除血管夹，关腹。再灌注6小时后再次经原切口开腹取肠道、血清标本。　　 3.实验分组　　 30只SD大鼠随机分成3组:假手术组（Sham，n=10），肠道淤血再灌注组(C/R，n=10)和HB-EGF治疗组(C/R+HB-EGF，n=10)。　　 假手术组给予除夹闭第一肝门以外的上述同样平行处理。HB-EGF治疗组在第一肝门阻断15分钟时，经空肠-回肠交界处向肠管内注入HB-EGF(剂量为600μg/kg，与含0.1％ BSA的PBS液配成1 ml)。肠道淤血再灌注组在同一时间以同样的方法注入1ml含0.1％ BSA的PBS液。　　 4.观察指标　　 4.1肠道组织病理学观察　　 取末段回肠，组织经甲醛固定，常规石蜡包埋与切片，HE染色，光学显微镜下观察。并根据其病理损伤程度评分（Chiu评分）。　　 4.2血清炎症因子的含量　　 经下腔静脉取血，采用ELISA法测定各组血清标本中TNF-α和IL-1β的含量。　　 4.3肠道组织髓过氧化物酶(MPO)活性　　 4.4肠道组织丙二醛(MDA)含量　　 硫代巴比妥酸法测定肠道组织MDA含量　　 4.5肠道上皮细胞凋亡指数（AI）　　 采用TdT介导的dUTP缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling assay,TUNEL)检测肠道上皮细胞凋亡情况，凋亡指数定义为TUNEL阳性细胞占总细胞数的百分比。　　 5.统计学分析　　 数据均以(x)±s表示，应用SPSS13.0统计软件分析。多组频数表资料的比较采用Kruskal-Wallis H。多组均数方差齐性，采用单因素方差分析(one-wayANOVA)及LSD两两比较;多组均数方差不齐，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3两两比较。统计分析中，检验标准为α=0.05。　　 结果:　　 1.肠道组织病理学改变　　 Sham组肠粘膜未见损伤;C/R组可见绒毛顶端下间隙增宽，部分绒毛脱落、破溃以及炎症细胞浸润;与C/R组相比，C/R+HB-EGF组回肠组织的病理损伤明显减轻。C/R+HB-EGF组回肠组织Chiu病理评分显著低于C/R组(P=0.002)。　　 2.血清炎症因子TNF-α和IL-1β的含量　　 C/R组血清TNF-α和IL-1β的含量显著高于Sham组(P=0.000，P=0.000);C/R+HB-EGF组TNF-α和IL-1β的含量显著低于C/R组(P=0.031，P=0.038)。　　 3.肠道组织MPO活性　　 假手术组、肠道淤血再灌注组、HB-EGF治疗组的MPO活性分别为(0.49±0.10)、（1.28±0.18）和（0.89±0.15）U/g。肠道淤血再灌注组MPO活性显著高于假手术组(P=0.000)，HB-EGF治疗组MPO活性显著低于肠道淤血再灌注组(P=0.000)。　　 4.肠道组织MDA含量　　 假手术组、肠道淤血再灌注组、HB-EGF治疗组的MDA含量分别为(1.32±0.23)、（3.05±0.39）和（2.39±0.27）nmol/mg protein。肠道淤血再灌注组MDA含量显著高于假手术组(P=0.000)，HB-EGF治疗组MDA含量显著低于肠道淤血再灌注组(P=0.000)。　　 5.肠道上皮细胞凋亡指数(AI)　　 肠道上皮细胞呈现棕褐色者为TUNEL阳性细胞。假手术组、肠道淤血再灌注组、HB-EGF治疗组的AI分别为（7.83±2.01）、（66.08±10.61）和(51.22±9.98)％。肠道淤血再灌注组AI显著高于假手术组(P=0.000)，HB-EGF治疗组AI显著低于肠道淤血再灌注组(P=0.014)。　　 结论:　　 1.本实验模型条件下，大鼠肠道淤血30分钟再灌注6小时可造成显著的淤血再灌注损伤。　　 2.肠管内HB-EGF给药可以减轻肠道的淤血再灌注损伤，其保护作用体现在HB-EGF可减轻肠道组织的病理损伤、降低炎症因子的表达、减少组织中炎症细胞的浸润、减轻肠道组织的氧化应激损伤以及抑制肠道上皮细胞的凋亡。　　 第二章:HB-EGF对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究　　 目的:　　 模拟肝脏移植手术，建立稳定的大鼠全肝缺血再灌注损伤模型。观察该模型条件下HB-EGF是否对肝脏也起保护作用，并对HB-EGF保护肝脏的机制进行初步探讨。　　 材料和方法:　　 1.实验动物和材料　　 雄性Sprague-Dawley大鼠，样本量为30只，周龄7～9周，体重217-255 g。清洁级，饲养条件符合SPF级标准，购自南方医科大学实验动物中心。HB-EGF购自美国R&D Systems公司。　　 2.大鼠自体肝移植模型（全肝血流阻断+经门静脉灌注）的建立　　 大鼠术前禁食12小时，不禁水。采用乙醚吸入麻醉，备皮消毒后取腹部正中纵行切口入腹。分离切断肝周韧带，充分游离肝脏;结扎并切断左膈下静脉、肝食管韧带静脉和右肾上腺静脉;游离肝上下腔静脉和肝下下腔静脉;打开肝十二指肠韧带，解剖第一肝门，游离门静脉、肝动脉和胆总管。至此除了出入肝脏的管道，肝脏已经完全游离。　　 无创血管夹夹闭门静脉和肝动脉，并开始计时;穿刺针顺血流方向刺入门静脉并予血管夹固定穿刺针，经穿刺针注射2ml肝素盐水(35 U/ml)使大鼠全身肝素化;阻断肝上下腔静脉和肝下下腔静脉，并在肝下下腔静脉的血管夹上方剪开约1mm的静脉壁作为流出道。4℃含肝素(12.5 U/ml)的乳酸林格液(20ml)以2.5 ml/min的速度通过输液泵经穿刺针行门静脉灌注，在灌注的同时以4℃乳酸林格液浇注肝脏表面降温。　　 灌注完成后拔出门静脉穿刺针，9-0 prolene线修补门静脉穿刺点，8-0prolene线修补肝下下腔静脉流出道;计时满30分钟后解除所有血管夹，结束无肝期;肝脏表面予38℃生理盐水浇注以快速复温;关腹。　　 再灌注6小时后再次经原切口开腹取肝脏、血清标本。　　 3.实验分组　　 30只SD大鼠随机分成3组:假手术组(Sham，n=10)，肝脏缺血再灌注组(I/R，n=10)和HB-EGF治疗组(I/R+HB-EGF，n=10)。　　 假手术组只将肝脏完全游离，不行血管穿刺、阻断。HB-EGF治疗组在门静脉阻断15分钟时，经空肠-回肠交界处向肠管内注入HB-EGF(剂量为600μg/kg，与含0.1％BSA的PBS液配成1ml)。肝脏缺血再灌注组在同一时间以同样的方法注入1ml含0.1％ BSA的PBS液。　　 4.观察指标　　 4.1血清ALT水平　　 4.2肝脏组织病理学观察　　 取右叶肝脏，组织经甲醛固定，常规石蜡包埋与切片，HE染色，光学显微镜下观察。并根据其病理损伤程度评分（Suzuki评分）。　　 4.3肝细胞凋亡指数(AI)　　 4.4肝脏组织髓过氧化物酶(MPO)活性　　 4.5炎症因子的含量　　 经下腔静脉取血，采用ELISA法测定各组血清标本中TNF-α和IL-1β水平的变化。肝脏组织匀浆后ELISA法测定各组肝脏组织中TNF-α和IL-1β的含量。　　 4.6肝脏组织细胞间粘附分子-1（ICAM-1）免疫组织化学法检测各组肝脏组织ICAM-1的表达情况。　　 4.7肝脏组织核转录因子-κB p65(NF-κB p65)和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白质免疫印迹（Western blotting）法检测各组肝脏核蛋白中NF-κB p65的表达情况以及总蛋白中IκBα的含量。　　 5.统计学分析　　 数据均以(x)±s表示，应用SPSS13.0统计软件分析。多组均数方差齐性，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD两两比较;多组均数方差不齐，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3两两比较。统计分析中，检验标准为α=0.05。　　 结果:　　 1.血清ALT水平　　 I/R组血清ALT水平显著高于Sham组（P=0.000），I/R+HB-EGF组血清ALT水平显著低于I/R组(P=0.034)。　　 2.肝脏组织病理学改变　　 Sham组肝脏未见损伤;I/R组可见明显的肝细胞肿胀、胞浆空泡形成、肝窦充血和炎性细胞浸润;与I/R组相比，I/R+HB-EGF组肝脏的病理损伤明显减轻。I/R+HB-EGF组肝脏Suzuki病理评分显著低于I/R组(P=0.045)。　　 3.肝细胞凋亡指数（AI）　　 肝细胞呈现棕褐色者为TUNEL阳性细胞。Sham组、I/R组和I/R+HB-EGF组的AI分别为(1.55±0.52)、(14.72±1.98)和(12.18±1.82)％。I/R组AI显著高于Sham组(P=0.000)，I/R+HB-EGF组AI显著低于I/R组(P=0.023)。　　 4.炎症因子TNF-α和IL-1β的含量　　 I/R组血清TNF-α和IL-1β水平显著高于Sham组(P=0.000，P=0.000);I/R+HB-EGF组TNF-α和IL-1β水平显著低于I/R组(P=0.013，P=0.027)。　　 I/R组肝脏组织TNF-α和IL-1β的含量显著高于Sham组(P=0.000，P=0.000);I/R+HB-EGF组TNF-α和IL-1β的含量显著低于I/R组(P=0.045，P=0.023)。　　 5.肝脏组织MPO活性　　 Sham组、I/R组和I/R+HB-EGF组的MPO活性分别为（0.88±0.10）、(1.87±0.13）和（1.72±0.11）U/g。I/R组MPO活性显著高于Sham组(P=0.000)，I/R+HB-EGF组MPO活性显著低于I/R组(P=0.005)。　　 6.肝脏组织细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达　　 Sham组未见或仅见微量的ICAM-1表达;I/R组ICAM-1的表达显著增加，尤其是在肝窦内皮细胞和中央静脉内皮细胞呈强阳性表达;HB-EGF可明显下调ICAM-1在肝脏的表达。　　 7.肝脏组织核转录因子-κB p65(NF-κB p65)和NF-κ3抑制因子α（IκBα）的表达　　 与Sham组相比，I/R组肝脏核蛋白中NF-κB p65的表达显著增强(P=0.000)，HB-EGF可显著抑制I/R大鼠肝脏核蛋白中NF-κB p65的表达(P=0.000)。　　 与Sham组相比，I/R组肝脏中IκBα的含量显著降低(P=0.000)，而HB-EGF给药后显著提高了I/R大鼠肝脏总蛋白中IκBα的含量(P=0.000)。　　 结论:　　 1.HB-EGF可以减轻大鼠自体肝移植模型条件下的肝脏缺血再灌注损伤。　　 2.HB-EGF抑制炎症反应是其减轻肝脏I/R损伤的机制之一。HB-EGF通过抑制NF-κ3的活化这一信号通路下调细胞间粘附分子的表达，减轻中性粒细胞的粘附和浸润，从而对肝脏起保护作用。

目录

摘要

前言

第一章 HB-EGF对大鼠肠道淤血再灌注损伤保护作用的研究

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

4、结论

第二章 HB-EGF对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

4、结论

参考文献

综述 肝素结合表皮生长因子样生长因子与肠道缺血再灌注损伤

中英文缩略词表

发表论文一览表

致谢

声明

统计学证明