WRKY转录因子调控火龙果果实甜菜素合成和糖代谢的分子机制

摘要

火龙果(Hylocereus)是一种近年来发展较快的的热带、亚热带水果，果实富含甜菜素、可溶性糖、有机酸和氨基酸等营养物质。甜菜素具有抗氧化、防癌等生物活性，可溶性糖的含量亦是决定果实风味品质的重要因素之一。因此，研究火龙果果实甜菜素合成和糖代谢的调控机制，对提高火龙果的品质及商品价值具有重要意义。WRKY是植物特有的转录因子家族,在植物生长发育、次生代谢、抗逆反应和激素信号转导中发挥重要作用。然而，WRKY转录因子是否参与火龙果甜菜素合成和糖代谢及其具体机制，尚不清楚。为此，我们以红肉火龙果品种‘大叶水晶’为研究对象，基于火龙果果实发育过程的RNA-seq表达谱，分离WRKY转录因子，研究其特性及对甜菜素合成和糖代谢关键酶基因的转录调控，以期阐明WRKY转录因子调控火龙果果实甜菜素合成和糖代谢的分子机制。主要研究结果如下：　　1. 基于火龙果转录组测序库，克隆获得了HpWRKY3、HpWRKY18和HpWRKY44等3个WRKY转录因子基因全长cDNA序列。氨基酸序列比对和进化树分析表明，HpWRKY3 和 HpWRKY44 有 2 个 WRKY 结构域，属于 WRKY 家族第 Ⅰ 类，HpWRKY18只有1个WRKY结构域，属于WRKY 家族第Ⅱa类。亚细胞定位显示，HpWRKY3、HpWRKY18和HpWRKY44均定位在细胞核，是核蛋白。转录活性分析表明HpWRKY3、HpWRKY18和HpWRKY44均表现出转录激活活性，是转录激活子。　　2. 实时荧光定量结果显示果实发育过程中，随着甜菜素合成，蔗糖、葡萄糖和果糖等含量增加，HpWRKY3、HpWRKY18 和 HpWRKY44、甜菜素合成相关基因HpCytP450-like1 以及糖代谢基因 HpSS2和HpAI2的基因表达水平均上升，说明HpWRKY3、HpWRKY18和HpWRKY44有可能参与调控火龙果甜菜素合成和糖代谢。　　3. 克隆获得了HpCytP450-like1、HpSS2和HpAI2等基因的启动子，分析表明它们均含有WRKY转录因子W-box（TTGAC）结合元件。　　4. 凝胶阻滞分析(EMSA)和双荧光素酶报告基因实验（Dual-luciferase）显示，HpWRKY3、HpWRKY18和HpWRKY44可以结合并激活HpCytP450-like1、HpSS2和HpAI2启动子的活性。　　综上所述，HpWRKY3、HpWRKY18和HpWRKY44通过直接调控甜菜素合成相关基因HpCytP450-like1和糖代谢基因HpSS2和HpAI2的表达，进而参与火龙果果实甜菜素合成和糖代谢。

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1 前言

1.1 植物甜菜素研究进展

1.2 果实糖代谢的研究现状

1.3 WRKY转录因子

1.4 WRKY转录因子的生物学功能

1.5 本研究的目的意义

2.1 供试材料

2.2 火龙果果实处理及取样方法

2.3 甜菜素的提取及测定

2.4 可溶性糖的测定

2.5 果实总RNA的提取及检测

2.5.1 总RNA的提取

2.5.2 果实总RNA浓度的测定及完整性检测

2.5.3 第一链CDNA的合成

2.6 qRT-PCR

2.7 HpWRKY3/18/44基因全长cDNA的克隆及检测

2.7.1 目的基因片段的获取与回收

2.7.2 与载体连接

2.7.3 转化

2.7.4 阳性克隆的鉴定

2.7.5 阳性克隆的测序

2.8 HpWRKY3/18/44的氨基酸序列和进化树分析

2.8.2 HpWRKY3/18/44进化树分析

2.9 HpWRKY3/18/44在烟草中的亚细胞定位

2.9.1 构建瞬时表达载体

2.9.2 农杆菌电击转化法及烟草叶背面注射

2.10 HpWRKY3/18/44的转录活性分析

2.11 HpWRKY3/18/44与甜菜素、糖代谢有关基因启动子的结合

2.11.1 甜菜素合成相关基因HpCytP450-like1和糖代谢有关基因HpSS2和HpAI2

2.11.2 HpWRKY3/18/44-GST融合蛋白的表达纯化

2.11.3 EMSA实验

2.11.4 化学发光法检测生物素标记的探针

2.12 Dual-luciferase实验

2.13 数据统计分析及作图

3 结果与分析

3.1火龙果果实生长发育过程中甜菜素含量的变化

3.2火龙果果实生长发育过程可溶性糖含量的变化

3.3 火龙果果实总RNA的提取

3.4 火龙果果实HpWRKY3/18/44/75基因的表达特性

3.4.1 HpWRKY3/18/44/75基因qRT-PCR引物的筛选

3.4.2 HpWRKY3/18/44/75在火龙果果实生长发育过程中的表达分析

3.5 火龙果果实HpWRKY3/18/44基因全长的克隆

3.6 HpWRKY3/18/44的序列分析

3.6.1 HpWRKY3/18/44编码氨基酸序列的基本特性

3.6.2 HpWRKY3/18/44氨基酸序列分析

3.6.3 HpWRKY3/18/44的进化树分析

3.7 HpWRKY3/18/44蛋白的亚细胞定位分析

3.8 火龙果HpWRKY3/18/44的转录活性分析

3.9 火龙果果实甜菜素合成相关基因HpCytP450-like1和糖代谢相关基因HpSS2和HpA

3.9.1 HpCytP450-like1、HpSS2和HpAI2基因qRT-PCR引物的筛选

3.9.2 HpCytP450-like1、 HpCytP450-like2、HpSS1、HpSS2

3.10 HpCytP450-like1、HpCytP450-like2、HpSS2和HpAI2基因

3.11 EMSA分析HpWRKY3/18/44与HpCytP450-like1、HpSS2和HpA

3.12 HpWRKY3/18/44体内激活 HpCytP450-like1、HpSS2和HpAI2

4 讨论

4.1 HpWRKY3/18/44属于WRKY转录因子

4.2 HpWRKY3/18/44参与调控火龙果甜菜素合成和糖代谢的机制研究

5 结论

致 谢

附 录