茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆、功能分析及转录因子分离

摘要

茶是世界三大无酒精饮料之一,富含茶多酚、生物碱、茶多糖、茶氨酸等活性物质.作为茶叶中的重要生物碱,咖啡碱因为具有兴奋神经、提神利尿等医学功效而尤其受到人们的广泛关注.N-甲基转移酶(N-methyltransferase,NMT)是参与咖啡碱生物合成的关键酶类,克隆NMT基因启动子及研究其功能,并分析与其相互作用的转录调控因子,对进一步揭示茶叶咖啡碱代谢调控,具有积极的意义和作用.　　本研究以英红9号茶树为材料,以克隆的重要功能基因yhNMT1为对象,利用hiTAIL-PCR法克隆yhNMT1基因启动子.通过生物信息学分析其顺式作用元件,借助对烟草植物转基因的瞬时表达和稳定表达技术,测定了该启动子的功能特性及环境胁迫因子对其功能的影响.利用酵母单杂交技术经文库构建与筛选克隆获得yhNMT1基因启动子对应的候选转录因子基因,并对克隆的转录因子亚细胞定位进行了研究.获得的结果主要如下:　　(1)yhNMT1基因启动子克隆及生物信息学分析　　克隆的yhNMT1基因启动子长767 bp,命名为PNMT1,序列经Plant CARE和PLACE等在线软件分析,预测的转录起始位点TSS位于翻译起始位点上游63 bp的碱基A处.PNMT1含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件,并具有多个与植物非生物胁迫相关的响应元件,如脱落酸响应元件ABRE,厌氧诱导响应元件ARE,茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif,热应答元件HSE,乙烯应答元件ERE,水杨酸响应元件TCA-element,光应答元件如AE-box等.　　(2)yhNMT1启动子在烟草叶片中的的瞬时表达分析　　根据启动子作用元件位置,以5'递减的不同长度的yhNMT1启动子替换pBI121载体中的CaMV35S启动子,构建出与GUS基因融合的系列载体pA、pB、pC、pD.对构建的载体利用烟草叶片进行GUS瞬时表达分析,组织GUS化学染色结果表明,4个载体转化的叶片中随插入启动子长度的增加而GUS染色加深,说明不同长度的yhNMT1基因启动子均具驱动GUS基因表达功能,且长度越长驱动能力越强.　　(3)yhNMT1启动子在转基因烟草中的稳定表达分析　　以含克隆全长yhNMT1启动子的载体pA对烟草进行农杆菌介导的转基因,对得到的转基因烟草进行GUS组织化学染色分析,结果表明在转基因烟草中yhNMT1启动子驱动GUS基因表达无组织特异性.定量PCR分析表明启动子驱动能力具有组织差异性,转基因烟草中GUS 基因表达量叶＞茎＞根,叶片中的表达量为根部的3倍.对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,叶片中GUS基因表达量在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响.　　(4)利用酵母单杂交技术克隆与yhNMT1启动子互作的转录因子　　根据酵母单杂交技术,将yhNMT1基因启动子构建进诱饵载体,经转化酵母Y1H细胞及筛选鉴定,获得抗AbA的新酵母菌株Y1H (PNMT1-AbAi).将茶叶cDNA和pGADT7-Rec载体共转化Y1H (PNMT1-AbAi)菌株,成功构建出酵母单杂交文库,其容量达2.7×106 cfu.经对文库筛选成功获得4个与启动子PNMT1互作的转录因子,分别命名为yhTF1、yhTF2、yhTF3、yhTF4.对克隆的转录因子预测分析表明,yhTF1属于NAC家族转录因子,yhTF2属于HD-Zip家族转录因子,yhTF3与NAC结构域蛋白具有约45%同源性,推测其可能参与相关非生物胁迫,yhTF4含有未知功能的DUF1685蛋白结构域并可能参与植物光反应系统.　　(5)转录因子亚细胞定位　　据PSORT在线工具进行亚细胞定位预测分析,四个转录因子蛋白定位于细胞核的概率分别是73.9%、91.3%、65.2%、26.1%.将4个转录因子基因分别构建进瞬时表达载体pGreen-C18-GFP并借助烟草叶下表皮细胞进行亚细胞定位,结果表明:yhTF1和yhTF3蛋白定位于细胞核,yhTF2蛋白定位于细胞核和细胞质,yhTF4蛋白定位于细胞质.

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1 前言

1.1植物中咖啡碱研究进展

1.1.1 咖啡碱生物合成途径

1.1.2 咖啡碱合成酶基因

1.1.3 NMT基因表达的研究

1.3转录因子对植物次生代谢调控研究进展

1.4研究目的及意义

2 实验材料和方法

2.1材料

2.1.1 材料

2.1.2 质粒和菌株

2.1.3主要试剂

2.1.4 主要试剂的配制

2.1.5 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 英红9号茶yhNMT1基因启动子克隆

2.2.2 启动子生物信息学分析

2.2.3 植物表达载体的构建

2.2.4 农杆菌介导的渗透法对烟草的瞬时表达

2.2.6 酵母单杂交文库筛选yhNMT1基因转录因子

2.2.7 yhNMT1基因转录因子序列分析

2.2.8 yhNMT1基因转录因子亚细胞定位

3 结果与分析

3.1英红9号茶yhNMT1基因启动子克隆及序列分析

3.1.1 英红9号茶叶DNA提取

3.1.2 hiTAIL-PCR方法克隆yhNMT1启动子

3.1.3 启动子序列分析

3.2 农杆菌介导的渗透法对烟草的瞬时表达

3.2.1 植物表达载体的构建

3.2.2 GUS瞬时表达分析

3.3 农杆菌介导遗传转化烟草的稳定表达分析

3.3.1 转基因烟草培养

3.3.2 阳性转基因烟草筛选鉴定

3.3.3 转基因烟草组织GUS活性化学染色及GUS表达量分析

3.3.4 不同胁迫处理条件下转基因烟草叶片GUS的表达分析

3.4 酵母单杂交文库筛选获得与yhNMT1基因作用的转录因子

3.4.1 yhNMT1启动子诱饵载体构建及转化Y1H酵母菌

3.4.2 Y1H (PNMT1-AbAi)菌株AbA最小抑菌浓度

3.4.3 酵母单杂交cDNA文库的构建

3.4.4 酵母单杂交文库构建及筛选

3.4.5 阳性克隆序列分析

3.4.6 yhNMT1基因转录因子的亚细胞定位

4 讨论

4.1 yhNMT1基因启动子克隆与序列分析

4.2 yhNMT1基因启动子瞬时表达分析

4.3 yhNMT1基因启动子稳定表达分析

4.4 与yhNMT1基因启动子相互作用转录因子的分析

4.5 本研究创新之处

4.6 进一步研究展望

5结论

致 谢