柱花草类受体蛋白激酶SgLRPK1功能的初步研究

摘要

柱花草（Stylosanthes guianensis）是一种产量高、营养价值高且用途广泛的优质豆科牧草，因其不耐低温的特性限制了向北推广，仅在热带和亚热带地区栽植。类受体蛋白激酶（receptor-like proteinkinase，RLK）是植物中重要的蛋白激酶，它主要作为信号分子的受体发挥功能。RLKs 位于细胞膜上，感知外界信号的刺激后，通过跨膜结构域将信号转导进胞内，使细胞发生磷酸化或去磷酸化的作用，进而开启或关闭下游靶蛋白。富亮氨酸重复类受体蛋白激酶（leucine-rich repeatsreceptor-like protein kinase，LRR-RLK）是 RLKs 中最大的一类亚家族。研究表明，RLKs 在植物激素信号转导、生长发育以及抗逆过程中发挥重要作用，但关于柱花草类受体蛋白激酶相关的研究鲜有报道。因此本论文对柱花草富亮氨酸重复类受体蛋白激酶基因 SgLRPK1的功能开展研究。　　柱花草富亮氨酸重复类受体蛋白激酶基因SgLRPK1完整的ORF为1800 bp，编码599个氨基酸。生物信息学分析，SgLRPK1蛋白具有N端信号肽，并且包括富亮氨酸重复序列的胞外结构域、单个跨膜结构域以及丝氨酸/苏氨酸胞内激酶结构域，属于典型的富亮氨酸重复类受体蛋白激酶。拟南芥LRR-RLKs包含15个亚家族，构建系统发育树表明，SgLRPK1蛋白与第六亚家族（LRR VI）亲缘关系最相近，自展支持率可达到99%。　　将长势一致的柱花草幼苗进行常温与低温处理，通过实时荧光定量 PCR 的方法检测 SgLRPK1 在低温胁迫和常温下的相对表达量。常温对照实验模拟了在一个光周期下SgLRPK1的相对表达量变化，SgLRPK1低温胁迫下的相对表达量趋势变化与之相同，均是在2 h时达到最高，随后表达量降低但均高于未处理前的表达量。并且，低温胁迫下SgLRPK1表达量提高的倍数高于常温对照组，由此得出SgLRPK1表达量上调受低温诱导，推测SgLRPK1可能参与柱花草对冷胁迫的响应过程。　　将SgLRPK1与绿色荧光蛋白（GFP）构成融合表达载体，与膜定位基因（OsRac3）共同转化水稻原生质体细胞，以绿色荧光蛋白（GFP）空载体转化水稻原生质体细胞作为对照。对照中整个原生质体细胞均能看到绿色荧光和红色荧光，而SgLRPK1与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体转化的水稻原生质体细胞中，只在细胞膜上有绿色荧光的表达，与膜定位基因（OsRac3）发出红光的位置一致，因此确定 SgLRPK1定位在细胞膜上。　　将SgLRPK1完整编码区接入pCAMBIA3301中，构建SgLRPK1过表达载体。通过农杆菌介导法将其转化柱花草，获得5株来自不同愈伤的SgLRPK1过表达柱花草植株。　　在SgLRPK1ORF 5’区和蛋白激酶功能区各设计一个靶位点，构建pYLCRISPR/Cas9-DB-SgLRPK1 打靶载体。通过农杆菌介导法转化柱花草，获得 10株阳性打靶植株。将这10株柱花草测序后的靶点序列输入DSDecodeM网站检测，显示均未打靶成功。　　根据多序列比对结果，选择SgLRPK1编码区356 bp的特异性序列，装载到pCAMBIA3301-RNAi上，构建SgLRPK1干涉载体。经农杆菌介导法转化柱花草，获得3株来自不同愈伤的阳性干涉SgLRPK1柱花草植株。

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