KISS1基因影响猪卵巢颗粒细胞分泌雌二醇(E2)的表达调控研究

摘要

卵巢卵泡的生长发育状态好坏直接决定了母猪繁殖性能的高低，颗粒细胞功能影响着卵泡的生长与闭锁，研究发现，KISS1在卵巢组织中可以促进卵泡的发育，影响颗粒细胞的功能，但KISS1在猪卵巢颗粒细胞中的表达调控机制及其细胞功能仍不清楚。本研究主要以长大二元杂母猪为研究对象，以猪的卵巢颗粒细胞为模型，首先研究KISS1自身的表达调控机制，进而研究该机制对颗粒细胞功能的影响，为完善KISS1在猪颗粒细胞中的表达调控提供分子依据，为解析影响长大二元杂母猪卵巢卵泡的生长、发育与成熟的因素提供分子基础。　　本研究主要通过qRT-PCR检测母猪排卵过程中的卵巢组织中KISS1的mRNA水平变化，扩增KISS1启动子区，构建含有KISS1启动子区缺失片段的重组载体，双荧光系统分析KISS1启动子区缺失片段的活性；生物信息学分析与ChIP验证KISS1启动子区潜在结合的转录因子，构建转录因子的超表达载体和siRNA，通过双荧光系统、qRT-PCR、Western Blot技术分析转录因子对KISS1转录活性、mRNA和蛋白水平的影响。构建KISS1的超表达载体和siRNA，转染进颗粒细胞，FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI检测颗粒细胞的凋亡情况，使用ELISA检测颗粒细胞上清中E2的浓度变化，使用qRT-PCR技术检测KISS1对E2合成相关因子、受体基因和PI3K通路基因的mRNA表达变化，确定KISS1在猪颗粒细胞的功能；　　本研究的主要结果如下：　　（1）猪卵巢组织中KISS1的mRNA在P2时的表达水平显著高于P1和P3。　　（2）PCR扩增得到KISS1启动子区-2261~+221共2482 bp，双荧光素酶系统分析得出-850~289 bp区域存在负向调控元件的结合位点。　　（3）转录因子预测网站预测和ChIP验证结果表明，转录因子STAT4和CEBPα分别特异性的结合在KISS1的-309 ~-297和-744 ~-733区域。　　（4）超表达STAT4和CEBPα后，KISS1启动子的转录活性降低，mRNA和蛋白表达水平显著降低；干扰STAT4和CEBPα的表达后，KISS1的mRNA和蛋白表达水平显著上升，颗粒细胞中E2的浓度降低。　　（5）超表达KISS1后，颗粒细胞的凋亡率降低，细胞上清中E2的浓度显著上升， ESR1和ESR2的mRNA表达水平显著上升；干扰KISS1的表达后，颗粒细胞的凋亡率升高，E2的浓度下降，Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD 、CYP19A、ESR1和ESR2的mRNA表达水平显著下降。　　（6）超表达KISS1后，PIK3CG、PI3CI和PDK的mRNA表达水平显著上升， FOXO3、TSC2和BAD的mRNA表达水平显著下降；干扰KISS1的表达后，PIK3CG、PI3CI、PDK、FOXO3、TSC2和BAD的mRNA表达水平下降，但差异不显著。　　由上述结果，本研究主要获得以下的结论：转录因子STAT4和CEBPα可以通过抑制KISS1的表达从而抑制KISS1对颗粒细胞分泌E2的促进作用。

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