反向构建带荧光标签的HP-PRRSV毒株及真核表达突变PRRSV N蛋白

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由PRRSV引起的一种严重危害当前养猪业的重要疾病.PRRSV的结构蛋白N蛋白是病毒粒子当中含量最丰富的蛋白,其目前已知的作用包括影响病毒的复制、构成病毒的骨架结构以及对易感动物或易感细胞的免疫产生干扰,N蛋白的研究对于PRRSV的感染机制的明确有着至关重要的作用.　　反向遗传操作技术为 RNA 病毒研究提供了一个强有力的平台,可以利用这个平台在 DNA 分子水平上,以基因重组、基因突变等手段来研究 RNA 病毒的复制、感染,RNA病毒蛋白的功能、病毒与宿主细胞之间的关系,同时抗病毒策略和标记疫苗等的发展也离不开反向遗传操作.本研究利用反向遗传操作技术将增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)基因组与TRS6启动子插入PRRS XH-GD毒株cDNA中,插入位置为ORF1和ORF2中间,构建形成EGFP-XHGD重组质粒,将重组质粒转染进入BHK细胞当中,获得可稳定表达绿色荧光且稳定感染Marc-145细胞及PAM细胞的EGFP-XHGD毒株,且能在Marc-145细胞上产生与原毒株一致的细胞病变.该EGFP-XHGD经生长曲线检测后,与XH-GD相比,保持了一致的感染趋势.经细胞传代至第 10 代验证,该绿色荧光能够稳定存在,并随着感染病毒的时间增长,细胞当中的荧光量逐渐增多.该带有荧光标签的毒株的成功构建为后续对于PRRSV感染易感动物及细胞的示踪性及其抗病毒研究提供支持.　　杆状病毒表达系统具有高水平表达和较大的基因容载量等特点,被广泛应用于各种重组蛋白和某些病毒载体的生产,原则上,杆状病毒表达系统可以生产任何外源蛋白,而且由于昆虫细胞可以进行糖基化、磷酸化、酰化和蛋白质折叠等多种翻译后修饰,所以经常被用来生产一些具有生物活性和/或免疫原性的蛋白质.PRRSV中N蛋白对病毒感染、复制能力及病毒骨架都有一定影响,本研究对N蛋白基因组的118和120磷酸化位点突变,构建出具有突变后的N蛋白基因组.并利用杆状病毒表达载体系统表达该突变基因组,成功获得突变N蛋白.经鉴定摸索,总结出较为优化的蛋白表达条件即重组质粒转染入Sf9细胞120h,可获得较大蛋白表达量;在蛋白纯化中,以浓度为500mM imidazole的洗脱液对蛋白洗脱效果较理想.为后续N蛋白的功能研究奠定基础.

目录

第一个书签之前