菊叶薯蓣愈伤组织诱导及毛状根系统的建立

摘要

在菊叶薯蓣的块茎中含有丰富的薯蓣皂苷，薯蓣皂苷是合成许多甾体激素药物的重要原材料，冠有“药用黄金”的美称。但是随着甾体激素药物的广泛使用和对野生菊叶薯蓣资源没有节制的开采，菊叶薯蓣的再生速度跟不上市场的需求，使得薯蓣皂苷也成为国内外最紧缺的药物原料之一。因此，提高菊叶薯蓣的种植产量以及薯蓣皂苷的含量成为目前急需解决的问题。本论文拟通过胚性愈伤组织形成菊叶薯蓣再生植株实现菊叶薯蓣的快速繁殖并提高产量；以胚性愈伤组织为外植体建立菊叶薯蓣毛状根系统，为皂苷合成途径关键基因的功能研究提供优良转化系统；同时通过筛选菊叶薯蓣块茎不同发育时期内参基因，为菊叶薯蓣皂苷合成途径的分子机理研究奠定基础。获得的实验结果如下：　　（1）以菊叶薯蓣不同外植体诱导愈伤组织，发现发现菊叶薯蓣种子诱导愈伤的最适培养基为MS+1 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA+2 mg/L KT+2 mg/L NAA，诱导率达55.6%；菊叶薯蓣组培幼苗叶片最适培养基为MS+2 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA +1 mg/LNAA，诱导率达58.3%；以菊叶薯蓣组培幼苗茎段、大田叶片和茎段为外植体诱导愈伤组织时，均对各激素组合表现不敏感，愈伤组织诱导情况无明显差异；叶片愈伤组织最适继代培养为MS+2 mg/L 2,4-D+2mg/L 6-BA+1 mg/L NAA，茎段愈伤组织最佳继代培养基为MS+2 mg/L 2,4-D；综上初步建立了菊叶薯蓣愈伤组织诱导体系。　　（2）以菊叶薯蓣茎段诱导愈伤组织和去根组培苗为外植体诱导毛状根，结果发现发根农杆菌 K599 对菊叶薯蓣组培苗茎段愈伤组织的诱导效果最佳，诱导率最高为18.92%；发根农杆菌 C58C1 对菊叶薯蓣去根组培苗诱导效果最佳，诱导率最高为42.86%；以菊叶薯蓣去根组培苗为外植体，在不同乙酰丁香酮浓度（AS）下用发根农杆菌K599侵染，随着AS浓度升高诱导率显著提高，在400 μmol/L的浓度下诱导率最高为40.91%；初步建立了菊叶薯蓣毛状根诱导系统，即以菊叶薯蓣去根组培苗为外植体，农杆菌K599侵染20 min，AS（400μmol/L）的MS固体培养基上黑暗共培养2 d，共培养后外植体经含头孢霉素（Cephalosporin,Cef, 250 mg/L）无菌水除菌，最后接种在Cef（250 mg/L）的MS固体培养基上于25℃恒温培养箱中培养诱导毛状根的产生。　　（3）根据已建立的菊叶薯蓣转录组数据库和已报道的传统内参，筛选出 8 个候选内参基因，利用实时荧光定量 PCR（qPCR）技术，结合 GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 三个统计学软件进行分析。结果表明，在菊叶薯蓣块茎不同发育过程中， TUB7和H2A2表达最稳定，为最佳内参基因。　　本论文为菊叶薯蓣愈伤组织的诱导体系和菊叶薯蓣毛状根系统的建立和完善奠定了基础，为薯蓣植物愈伤组织诱导和毛状根诱导提供了宝贵的参考意义；为菊叶薯蓣皂苷合成途径的分子机理研究奠定基础，也为近源薯蓣属植物内参基因的筛选提供线索。

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