桔小实蝇雄成虫对甲基丁香酚趋性的分子机理研究

摘要

桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel) 是一种世界性的重要果蔬害虫，具有寄主范围广、繁殖能力强、生命周期长和世代重叠等特性，可严重为害芒果、番石榴、甜橙、杨桃等超过250种具有商业价值的热带和亚热带经济水果。该虫主要以杂食性幼虫蛀果取食的方式为害，因其雌成虫产卵隐蔽、幼虫潜食为害、入土化蛹等特点，同时桔小实蝇野生种群对有机磷类、拟除虫菊酯和阿维菌素等杀虫剂产生了严重的抗性，导致防治工作较为困难。根据持续控制、安全有效的防治思路，防控成虫是目前防治桔小实蝇的主要策略。甲基丁香酚（Methyl eugenol，ME）是一种天然的苯基丙烷化合物，对桔小实蝇性成熟雄成虫有强烈的引诱作用，被广泛应用于监测、诱杀、根除桔小实蝇田间种群。但由于ME对人类健康有致癌性、只能诱捕性成熟雄成虫的缺点，不适宜长期田间使用；而以ME为模板合成的衍生物不仅引诱效果差且工艺复杂，因此开发新型绿色桔小实蝇引诱剂成为亟需解决的科研问题。利用“逆化学生态学（Reverse Chemical Ecology）”的策略，以嗅觉通讯蛋白为靶标分子，开发安全性高、专一性强的昆虫行为调控剂来防治目标害虫成为目前研究的热点。因此，阐明ME引诱桔小实蝇雄成虫的分子机制，不仅有助于揭示桔小实蝇嗅觉识别的分子机制，而且也对以ME分子结构为模板或ME作用的嗅觉蛋白为靶标研发新型引诱剂具有重要的指导意义。然而，桔小实蝇雄成虫识别ME的分子机理至今尚未明确。根据昆虫气味识别机制，本文通过采用蛋白质组学、转录组学、荧光定量PCR、爪蟾卵母细胞-双电极电压钳、RNAi等技术对桔小实蝇触角中参与识别ME过程的潜在靶标嗅觉基因的表达模式及功能进行了系统深入的研究，主要研究结果如下：　　1. OBP2在桔小实蝇雄成虫识别ME过程中起关键作用　　首先，我们在实验室内采用“二次诱捕法”对桔小实蝇雄成虫进行汰选，经过6世代的汰选，对ME无趋性的性成熟雄成虫比例显著上升且保持稳定。然后，通过iTRAQ相对和绝对定量同位素标记技术分析、鉴定对ME有趋性和无趋性性成熟雄成虫触角的差异蛋白质组学，共成功鉴定出4,622个蛋白质，其中277个蛋白质表达量差异性显著，在有趋性的雄成虫触角中共有192个蛋白质表达量上调，85个蛋白质表达量下调。荧光定量PCR（qRT-PCR）进一步验证了iTRAQ蛋白组学结果的准确性和可靠性。根据iTRAQ蛋白组学结果和qRT-PCR结果，我们筛选出了4个气味结合蛋白OBP2、OBP50c、OB56D-1、OB56D-2作为靶标基因进行功能研究。桔小实蝇性成熟雄成虫（15 d）对ME的趋性显著高于未性成熟雄成虫（3 d）和性成熟雌成虫（15 d），同样的，OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D-2基因在性成熟雄成虫触角中的表达量也显著高于在性未成熟雄成虫和性成熟雌成虫触角中的表达量。ME刺激可以显著诱导雄成虫触角OBP2、OB56D-1和OB56D-2的表达量上调，但对OBP50c的表达量无影响。注射dsRNA沉默OBP50c、OB56D-1和OB56D-2基因后不影响雄成虫对ME的趋性能力，但沉默OBP2基因后，雄成虫对ME的趋向能力显著降低。以上结果表明OBP2在桔小实蝇性成熟雄成虫识别ME的过程中起关键性作用。　　2. OR88a调控桔小实蝇雄成虫对ME的趋性　　迄今为止，参与桔小实蝇雄成虫识别ME的气味受体ORs的种类和功能尚未知。为了进一步阐明ME引诱桔小实蝇雄成虫的分子机制，我们通过高通量测序技术对ME处理组和矿物油（MO）对照组的桔小实蝇性成熟雄成虫触角进行转录组测序分析，成功注释到19,933个基因，其中显著差异表达基因为4,433个，在ME处理的雄成虫触角中共有3,813个基因表达量上调，620个基因表达量下调。随后，荧光定量PCR（qRT-PCR）验证了RNA-Seq结果的准确性和可靠性。研究发现，气味受体OR63a-1和OR88a在ME诱导刺激后大量表达。通过异源真核表达、双电极电压钳检测发现，共表达 OR63a-1/Orco 的爪蟾卵母细胞对 ME 刺激反应不明显；相反，共表达OR88a/Orco的卵母细胞对ME刺激反应强烈，反应强度呈现出明显的剂量效应。RNAi沉默OR63a-1不影响雄成虫对ME的趋性，但沉默基因OR88a显著降低了桔小实蝇性成熟雄成虫对ME的趋性能力。因此，我们初步推测OR88a可能是识别ME的靶标气味受体，参与调控桔小实蝇雄成虫对ME的趋性行为。　　3. 桔小实蝇雄成虫识别ME的分子模型　　综合上述的研究结果和已有的文献报道，我们初步构建了桔小实蝇性成熟雄成虫识别、定位ME的分子模型：当ME气味分子通过桔小实蝇雄成虫触角感受器表皮的小孔进入触角的淋巴液后，气味结合蛋白（OBP2或OBP83a-2）迅速与ME结合，形成复合物通过淋巴液到达气味受体OR88a，然后激活OR88a/Orco异源二聚体产生动作电位，信号传导进入桔小实蝇大脑并最终产生趋向 ME 的行为反应；激活OR88a/Orco异源二聚体后，ME气味分子被气味降解酶ODEs降解。

目录

第一个书签之前

第一章 前言

1.1 桔小实蝇生物学和生态学特性

1.1.1 桔小实蝇为害特点

1.1. 2 桔小实蝇适生环境

1.1.3 桔小实蝇入侵风险评估及适生性分析

1.1.4 桔小实蝇化学生态学研究概述

1.1.4.1 昆虫嗅觉感受机理简介

1.1.4.2 桔小实蝇嗅觉反应行为

1.2 应用甲基丁香酚防控桔小实蝇的研究进展

1.2.1 甲基丁香酚引诱桔小实蝇雄成虫的生理学基础

1.2.2 甲基丁香酚诱捕桔小实蝇影响因素及田间应用

1.2.3 甲基丁香酚衍生化合物

1.2.4 需解决的科学问题

1.3 本研究目的和研究思路

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究思路

1.4 研究技术路线

第二章 气味结合蛋白（OBPs）在桔小实蝇雄成虫识别甲基丁香酚过程中分子功能的研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 供试昆虫

2.2.2 供试试剂与耗材

2.2.3 主要仪器

2.2.4 溶液的配置

2.2.5 试验方法

2.2.5.1 人工筛选对ME无趋性的桔小实蝇性成熟雄成虫

2.2.5.2 iTRAQ技术分离、鉴定对ME有无趋性桔小实蝇雄成虫的触角差异蛋白

2.2.5.2.1 桔小实蝇雄成虫触角蛋白质提取、消化和iTRAQ标记

2.2.5.2.2 肽段液相色谱法分级和质谱鉴定

2.5.2.2.3 蛋白质功能与通路注释

2.5.2.2.4 蛋白质功能及通路富集分析

2.5.2.2.5 蛋白质聚类分析

2.2.5.3.1 雄成虫触角RNA提取步骤

2.2.5.3.2 RNA的浓度与质量检测

2.2.5.3.3 cDNA合成

2.2.5.3.4 qRT-PCR验证嗅觉相关蛋白mRNA表达量

2.2.5.4 OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D-2基因序列分析与系统发育树构建

2.2.5.5 不同日龄桔小实蝇成虫对ME的趋性及OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D

2.2.5.6 ME对OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D-2在性成熟雄成虫触角内表达

2.2.5.7 OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D-2生物学功能研究

2.2.5.7.1 OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D-2基因dsRNA引物设计

2.2.5.7.2 OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D-2基因T7引物PCR扩增

2.2.5.7.3 PCR反应产物电泳观察

2.2.5.7.4 PCR反应产物回收、纯化

2.2.5.7.5 胶回收产物T载体克隆连接反应

2.2.5.7.6 T载体连接产物在大肠杆菌感受态细胞转化

2.2.5.7.7 菌落PCR验证

2.2.5.7.8 甘油存菌

2.2.5.7.9 质粒提取

2.2.5.7.10 PCR扩增，胶回收、纯化PCR产物作为dsRNA合成的模板

2.2.5.7.11 合成dsRNA

2.2.5.7.12 RNAi沉默雄成虫OBP2、OBP50c、OB56D-1和OB56D-2效率检

2.2.5.8 数据处理

2.3 结果与分析

2.3.1 人工汰选后对甲基丁香酚无趋性雄成虫比例的变化

2.3.2 对甲基丁香酚有趋性和无趋性雄成虫触角iTRAQ蛋白组鉴定与结果分析

2.3.3 触角差异蛋白GO功能注释与分析

2.3.4 触角差异蛋白KEGG通路分析

2.3.5 qRT-PCR检测差异蛋白编码基因在有、无趋性雄成虫触角的表达量

2.3.6 气味结合蛋白进化树分析

2.3.7 性别与日龄对桔小实蝇成虫对甲基丁香酚趋性及OBPs表达量的影响

2.3.8 甲基丁香酚显著诱导雄成虫触角OBP2表达量上调

2.3.9 OBP2、OBP50c、OB56D-1、OB56D-2生物学功能的研究

2.3.9.1 dsRNA合成产物鉴定

2.3.9.2 OBP2调控桔小实蝇性成熟雄成虫对甲基丁香酚的趋性行为

2.4 小 结

第三章 气味受体（ORs）在调控桔小实蝇雄成虫对甲基丁香酚趋性行为的分子功能研究

3.1 引言

3.2 试验方法

3.2.1 供试昆虫

3.2.2 供试试剂

3.2.3 主要仪器

3.2.4 溶液的配置

3.2.5 桔小实蝇雄成虫处理与触角样品收集

3.2.6 触角总RNA提取、cDNA文库构建及Illumina测序

3.2.7 序列De Novo组装和Unigenes功能注释

3.2.8 差异表达基因的筛选与分析

3.2.9 差异表达基因GO功能注释、GO富集与KEGG富集分析

3.2.10 荧光定量PCR（qRT-PCR）验证基因表达量

3.2.11 OR63a-1和OR88a基因序列分析与系统发育树构建

3.2.12 不同日龄和日节律对桔小实蝇雄成虫对ME的趋性及OR63a-1、OR88a表达量的影响

3.2.13 OR63a-1和OR88a在爪蟾卵母细胞表达和双电极电压钳记录

3.2.13.1 OR63a-1、OR88a和Orco表达载体构建

3.2.13.2 OR63a-1、OR88a和Orco基因cRNA合成

3.2.13.3 爪蟾卵母细胞表达和双电极电压钳记录

3.2.14 RNA干扰验证OR63a-1和OR88a的生物学功能

3.2.15 数据分析

3.3 试验结果

3.3.1 RNA-seq数据质控与评估

3.3.2 不同处理组样本转录组测序与De novo组装分析

3.3.3 转录组Unigenes基本功能注释

3.3.4 ME处理组与MO对照组桔小实蝇雄成虫触角差异表达基因分析

3.3.5 差异表达基因的GO分类、GO富集与KEGG通路富集分析

3.3.6 与嗅觉传导相关的差异表达基因鉴定

3.3.7 qRT-PCR检测差异基因的表达量

3.3.8 气味受体进化树分析

3.3.9 日龄和日节律对桔小实蝇雄成虫趋向ME能力及OR63a-1、OR88a表达量的影响

3.3.10 爪蟾卵母细胞系统研究OR63a-1、OR88a分子功能

3.3.11 OR88a调控桔小实蝇雄成虫对ME的趋性行为

3.3.12 桔小实蝇雄成虫识别、转导ME的分子模型

3.4 小结

4.1 结论

4.2 讨论

4.2.1 OBP2参与桔小实蝇雄成虫识别ME的分子过程

4.2.2 OR88a调控桔小实蝇性成熟雄成虫对ME的趋性行为

4.2.3 桔小实蝇性成熟雄成虫识别ME的分子模型

4.3 本研究的创新点

4.4 有待进一步解决的问题

致 谢

参考文献

附录1 嗅觉蛋白质二级质谱图谱

附录2 发表论文和获奖情况