2015~2017年广东地区H7N9亚型流感病毒的遗传进化及致病性研究

摘要

2013年3、4月，我国上海、安徽、浙江等地首次暴发H7N9亚型流感病毒感染人事件，引发全球关注。截至2017年上半年，该病毒已经引发五波疫情，严重威胁我国的公共卫生安全。与前四波疫情相比，第五波疫情出现突变毒毒株，该突变株对家禽具有高致死率，给养禽业造成重大损失。因此，对H7N9亚型流感病毒的遗传进化以及致病性的研究非常重要。　　为及时了解广东地区家禽群中H7N9亚型流感病毒的流行趋势、基因序列的遗传进化以及致病特性，本实验室收集了2015～2017年广东地区活禽交易市场以及部分养殖场家禽的样品，并检测样品中H7N9亚型流感病毒的携带情况。　　根据不同时间、不同地区分布的原则，本论文筛选50株广东源的H7N9亚型流感病毒作为研究对象，为对比广东源毒株与北方同时期毒株，又选取分离自第四波的16138和第五波的17528作毒株代表。对52株H7N9亚型流感病进行全基因组测序，结果显示：第五波的20株分离株中有13株病毒发生突变，突变株的HA蛋白裂解位点处插入多个连续碱性氨基酸，呈现PEVPKRKRTAR↓GLF、PEVPKRRRTAR↓GLF、PEVPKGKRTAR↓GLF三种形式，符合高致病性禽流感病毒的分子特征。分离自第四波的32株H7N9毒株均为低致病性毒株，而第五波疫情中出现高致病性毒株，并与低致病性毒株同时流行。　　对32株H7N9第四波毒株与20株第五波毒株的遗传进化分析获知：第五波流行毒株由第四波流行毒株进化而来；HA和NA基因的进化树可分为长三角和珠三角分支，高致病性毒株的HA、NA均为长三角分支。特别值得关注的是，3株低致病性毒株（15567、15575、17064）其HA基因属于长三角分支，而NA基因属于珠三角分支，提示部分低致病性毒株的HA、NA基因发生长三角分支与珠三角分支的重组。此外，15567和15575毒株的6个内部基因均与A/Duck/HongKong/Y439/97（H9N2）的内部基因亲缘关系最近，表明H9N2亚型流感病毒参H7N9亚型流感病毒的内部重组。根据8个基因划分不同进化小分支，可将52株H7N9毒株分为35个基因型（G1～G35）。第五波流行毒株中G25、G28的毒株居多，第四波流行毒株中G4、G18的毒株居多。通过对关键氨基酸位点的分析，结果显示部分关键位点有差异，比如：HA蛋白的226位点，第四波流行株均为L，与186位点双突变，而第五波流行株则为Q。PB2蛋白的588位点有19株为V，27株为A，6株为T。PB1蛋白368位仅15567、15575、17527、17528为I，其余均为V。　　本试验筛选3株第四波的毒株和2株第五波的毒株，以106EID50/200 μL病毒剂量对SPF级鸡和BALB/c小鼠进行人工感染试验。结果表明：分离自第五波的17390、17528毒株比第四波15709、15567、16138毒株对鸡和小鼠的致病力、传播复制能力均增强。4周龄SPF鸡感染第五波17390、17528毒株后，呈现高致病性禽流感的临床特征，一周内急性死亡，死亡率高达100%，出血严重，剖检可见主要造成肺和脑组织病变。显微镜下观察其HE染色切片可见肺出血淤血、炎性渗出物，间质性肺炎，病毒性脑炎等。此外，同时期的不同毒株对小鼠致病性有差异。小鼠感染广东源173 90毒株后，死亡率为100%；而感染同时期的北方源17528毒株后，小鼠体重先下降后逐渐恢复，不死亡。肺脏、鼻甲骨是病毒主要的复制部位。

目录

第一个书签之前

1 前言

1.1 禽流感概述

1.2 禽流感病毒的病原学特性

1.3 H7N9亚型流感病毒

1.3.1 H7N9亚型流感毒病病原学特性

目前，在禽类中能分离到的H7亚型流感病毒包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N6、H7N7、H7N

Wu等进一步研究发现，该新型病毒发生了两次重组。第一次是欧亚起源的野鸟和中国野鸟之间发生重组，前者提

Xiong X等人通过分析H7N9亚型流感病毒的受体结合位点，发现某些关键氨基酸大部分已发生突变，如

H7N9亚型流感病毒的NA蛋白茎部区发生69～73位氨基酸的缺失，Matsuoka Y等研究认为颈部

禽流感病毒的PB1-F2蛋白与病毒的毒力密切相关

人流感和猪流感病毒比较常见NS1蛋白在C末端PDZ结合区有氨基酸缺失，与病毒的致病性和对哺乳动物的宿

1.3.2 H7N9禽流感的流行及危害

1.4 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.2 实验试剂以及配制

2.4 相关生物学软件和引物设计

2.5 病毒的分离与纯化保存

2.6毒株材料

2.7 H7N9亚型流感的基因扩增

2.7.1 病毒RNA的提取与反转录

2.7.2 基因组各片段的PCR扩增

2.7.3 凝胶电泳与目的片段回收

2.8 全基因组的序列分析及遗传进化分析

2.9.1 鸡胚半数感染量（EID50）的测定

2.9.2 SPF鸡感染病毒后死亡、排毒、脏器中病毒含量等情况

2.10 H7N9亚型流感对BALB/c小鼠的致病性

3.2 H7N9亚型流感的基因序列分析

3.2.1 HA基因的序列分析

M基因全长为1027个核苷酸，其中包括两个开放阅读框，分别编码M1蛋白和M2蛋白。编码M1蛋白的开放

3.3 H7N9亚型流感病毒对SPF鸡的致病性

16138、15567、15709毒株分离自第四波，呈低致病性禽流感分子特征。17390、17528

表 3.11 5株H7N9亚型流感病毒的信息

3.3.4 SPF鸡各脏器中病毒的复制情况

3.5病理组织变化

4 讨论

4.1 广东地区H7N9亚型流感病毒的流行分布

4.2 H7N9亚型流感的基因序列