欧洲型PRRSV的流行病学调查、分离鉴定及ORF5基因变异分析

摘要

猪繁殖与呼吸道综合症（PRRS）是一种在猪身上发生的烈性传染病，我国将它划分至一类传染病，患病母猪主要导致死胎、流产、木乃伊胎等繁殖障碍，病原为猪繁殖与呼吸道综合症病毒（ Porcine reproductive and respiratory syndrome virus ， PRRSV）。美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(NA-type PRRSV)及其变异毒株在我国流行已经有数十年之久，传播至各个地区。但近年来的有流行病学调查的数据表明，我国部分地区有检测到欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(EU-type PRRSV)，这两种病毒不发生交叉保护但可以混合感染并且病毒可以实现重组。因此，蓝耳病的预防不仅要对之前就广泛流行的美洲型PRRSV进行控制，同时又要预防新传入的欧洲型PRRSV。　　本实验室主要针对近两年来我国华南地区PRRSV的流行情况进行了病原的流行病学调查研究，获得了9株阳性样品。选取3株毒株进行RT-PCR扩增，并对ORF5基因进行遗传变异分析。利用PAMs细胞成功分离了一株欧洲型PRRSV命名为PRRSV CN-2016。　　PRRSV的ORF5阅读框在所有开放阅读框中基因变异最明显，通过核苷酸序列对比显示欧洲型与美洲型ORF5基因同源率仅为55%~70%。本研究根据PRRSV的基因序列比对核苷酸差异性使用简并碱基设计并合成两对引物，对应的欧洲型和美洲型毒株PCR产物分别为1296bp和198bp，引物命名为EU-ORF5和NA-ORF7。经过反应条件的优化和大量样品的检测分析，成功建立鉴别欧洲型和美洲型PRRSV的PCR分别检测方法。　　利用该方法检测广东省2015~2017年采集的来自不同地区的310份疑似PRRS的肺部及淋巴结病料，PRRSV平均阳性率达到28%，欧洲型PRRSV检测出9份阳性率为2.9%。在所有PRRSV阳性病料中欧洲型PRRSV占了10.4%。毒株同源性分析所选取的三个毒株与在欧洲地区（荷兰、丹麦、比利时、西班牙）分离的10个毒株（LV4.2.1、LV、Lena、MLV-DV等）之间的核苷酸同源性为82.8%~88.9%。遗传进化树分析显示，3株PRRSV毒株均位于G2组，同为G2组毒株分别来自比利时和中国，提示这些在中国大陆流行的毒株可能来源于比利时。　　将检测为阳性的3株检测基因型为欧洲PRRSV的毒株经离心并除菌过滤，接种于制作好的猪肺泡巨噬细胞上，连续进行盲传。传至第3代时出现细胞聚集皱缩等细胞病变，最终成功将其中一株欧洲型PRRSV毒株CN-2016分离并稳定传至第6代。根据GeneBank中PRRSV代表毒株设计简并碱基（包含部分ORF4和ORF6基因）的引物，利用RT-PCR方法从细胞培养物中扩增大小约1296bp片段，克隆入pMD18-T载体后进行测序分析，表明分离株与13V117和Lena等比利时毒株进化树处于同一分支，核苷酸同源性为86.8%和82.4%，分离毒株可能来源于比利时。　　本研究显示中国大陆有欧洲型PRRSV入侵，我国广泛使用的美洲毒株疫苗对欧洲型PRRSV的交叉保护力弱，因此在疾病防控策略上需要引起进一步思考。

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1 前言

1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒简介

1.2 PRRSV的一般特性

1.2.1 病毒的形态特征和基因组结构

1.2.2 病毒编码的蛋白

1.3 病毒的复制

1.4 PRRSV分子的遗传变异

1.5 PRRSV流行病学的研究

1.6 PRRSV的致病性

2 2015~2017年我国华南地区欧洲型PRRSV的流行病学调查

2.1 材料

2.1.1 病料样品与毒株

2.1.2 主要实验材料

2.2 方法

2.2.1引物设计与合成

2.2.2 病毒RNA的提取和cDNA的合成

2.2.3 PCR菌液序列测定与分析

2.3 结果

2.3.1 欧洲型PRRSV流行病学统计调查

2.3.2 PRRSV ORF5基因遗传变异分析

3.1 材料与方法

3.1.1 细胞、质粒、病毒及工程菌

3.1.2 主要试验试剂及耗材

3.1.3 方法

3.1.4 PAMs细胞的制作

3.2 病毒的分离鉴定

3.2.1 病毒的分离

3.3 结果与分析

3.3.1 PAMs细胞的病毒分离

3.3.2 病毒RT-PCR鉴定

3.3.3 PRRSV ORF5的序列测定

3.3.4 ORF5基因序列的同源性分析

3.3.5 CN-2016株ORF5基因序列的进化关系分析

3.3.6 ORF5基因氨基酸位点变异分析

4 讨论

5 总结

致 谢

参考文献