猪细胞色素P450 3A亚族代谢黄曲霉毒素B1的分子机制研究

摘要

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的黄曲霉毒素中毒性最强的一种，其在体内可以被细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）催化生成具有基因毒性的代谢产物黄曲霉毒素-8,9-环氧化物(aflatoxin-8,9-epoxide，AFBO)。AFBO可以通过与DNA结合导致基因突变从而诱发癌症。同时AFBO也可以与细胞内的蛋白结合，从而导致细胞死亡，因此 AFB1被定义为Ⅰ类致癌物质。在 AFB1的代谢过程中CYP3A亚族起到重要作用。畜禽通过饲料接触 AFB1的概率更高，受到的危害更大，而猪作为畜牧业中不可或缺的组成部分，使用猪来研究药物和其他外源化合物的代谢也逐渐受到人们的关注。已有的报道证明人CYP3A家族以及猪CYP3A29在AFB1在体内活化过程中发挥重要作用，但对于猪CYP3A亚族其他成员是否能代谢AFB1并不清楚。　　为了了解猪细胞色素P4503A亚族代谢AFB1的分子机制，我们尝试利用大肠杆菌原核表达体系获得重组CYP3A22和CYP3A46蛋白。虽然尝试了不同的表达条件和改造策略，但一直没有得到有活性的重组CYP3A22蛋白。通过对CYP3A46的密码子优化，我们成功得到重组CYP3A46蛋白。并且使用圆二色谱和CYP常用的还原光谱的方法确定重组蛋白具有良好的结构和活性。通过构建蛋白的体外孵育体系确定CYP3A46可以代谢CYP3A的模式底物尼福地平，说明重组蛋白具有良好的活性。并且通过体外的孵育实验，我们第一次证明了猪CYP3A46能够代谢AFB1生成AFBO。　　为了研究CYP3A46代谢AFB1的分子机制，本研究以CYP3A4的晶体结构为模型，使用在线服务器SWISS-MODEL构建了CYP3A46的三维模型。进一步通过分子对接软件AutoDock 4.2将CYP3A46的三维模型与配体AFB1进行对接，通过对对接结果进行聚类分析筛选出可能的构象，并通过PyMOL分析在代谢过程中可能发挥作用的氨基酸残基，进一步通过定点突变和突变体催化活性变化来进行验证。我们构建并表达了F108A、S119A、K212A，F215、F304A和T309A突变体蛋白。通过实验发现F108A和F215A突变体的代谢活性降低为野生型的1/3；S119A和T309A的活性也有一定程度降低；F304A突变体使代谢活性上升为野生型的两倍。通过测量突变体的酶动力学参数，我们发现S119位点可能通过影响两个AFB1分子之间的协同发挥作用。不同于人CYP3A4的F304A突变体导致催化活性的丧失，我们发现CYP3A46的F304A突变体代谢AFB1的活性大约升高2倍，根据我们的分子对接结果，我们推测CYP3A46的F304可能因为空间位阻的原因影响了AFB1的结合，当F304突变为丙氨酸后AFB1与S119形成氢键促进了催化反应的进行。这个推测也在F304W和S119A/F304A中得到了证实。T309位点可能与AFB1形成氢键稳定AFB1与蛋白的结合。我们也检测了α-萘黄酮可以作为效应物对于AFB1代谢的激活作用，发现α-萘黄酮可以有效促进猪CYP3A46代谢的AFB1活性。通过比较激活的倍数我们发现α-萘黄酮可能通过影响CYP3A46的I螺旋发挥作用。同时在实验中发现CYP3A29和CYP3A46代谢AFB1活性差异比较大，通过分子对接、序列对比发现在CYP3A46和CYP3A29 在370位置的氨基酸的苏氨酸和丙氨酸的差异在这个过程中可能发挥重要作用。根据我们的分子对接和蛋白活性测定结果推测370位置的氨基酸可能通过影响蛋白内两个AFB1分子的协同从而影响对AFB1的代谢活性。

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