GmWRKY16异源转化拟南芥增强抗旱性和耐盐性的功能研究

摘要

大豆（Glycine max L. Merr）是世界上重要的油料作物和经济作物。干旱、盐胁迫是限制大豆生长发育和产量的主要非生物胁迫。本研究从大豆华春2号中克隆出GmWRKY16基因，对该基因进行了生物信息学分析、转录自激活验证、亚细胞定位、组织表达等试验，并对其在NaCl、NaHCO3、PEG-6000、ABA胁迫下的表达水平进行了分析。主要研究结果如：　　1 GmWRKY16基因CDS序列长为1014bp，编码337个氨基酸，具有一个WRKY结构域。进化树构建分析，GmWRKY16 、GmWRKY129 、AtWRKY8、AtWRKY28、AtWRKY48、AtWRKY71 在同一分支，都属于 WRKY IIc 亚组， GmWRKY16 与GmWRKY129蛋白相似度高达93%。将GmWRKY16基因CDS序列插入到载体Pgbkt-7中，并转化酵母。实验结果表明GmWRKY16具有转录自激活活性。将GmWRKY16基因CDS序列插入到载体pCAMBIA1302中，将重组质粒转化到烟草，结果显示， GmWRKY16在细胞核上表达。　　2 用 Real-time RT-PCR 研究分析GmWRKY16 基因的组织表达模式，结果表明，该基因在老叶，花，根和种子中相对表达量较高，其中在老叶中的表达大量最高。在绿荚，新叶和茎中的相对表达量较低。对GmWRKY16基因的逆境胁迫响应及表达模式进行分析，分别NaCl (200mM)、NaHCO3(80mM)、PEG(20％)和ABA(100uM) 进行胁迫处理，该基因在各种胁迫下表达均显著上调。　　3 GmWRKY16基因异源转化拟南芥获得转基因阳性苗。对拟南芥株系种子，幼苗，壮苗期分别进行了表型鉴定分析。过表达GmWRKY16拟南芥株系发芽率和根长比WT都显著提高。在相同的干旱和高盐胁迫下，过表达GmWRKY16的拟南芥植株与WT拟南芥植株相比，转基因拟南芥植株更加耐旱耐盐。在10uM ABA胁迫处理后， WT比GmWRKY16转基因株系的气孔密度大，GmWRKY16转基因株系的孔径度比WT小，长宽也都显著差异。叶片失水的快慢与气空调节相关，结果表明，GmWRKY16转基因植株失水较慢是由于气孔的闭合所致。　　4 GmWRKY16诱导拟南芥抗逆相关下游基因的表达,这些相关基因在WT拟南芥中不经过干旱胁迫处理，基因的相对表达量和干旱胁迫处理下的表达量并没有明显的区别。而在GmWRKY16转基因株系拟南芥植株中经过干旱胁迫处理后基因的相对表达量明显要高于未胁迫处理的。说明GmWRKY16诱导拟南芥抗逆相关下游基因的表达增强了拟南芥的抗逆性。

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1文献综述

1.1 植物产生抗逆的生理和分子机制基础

1.1.1 植物产生抗逆的生理机制

1.1.2 植物产生抗逆的分子机制

1.2 植物逆境胁迫的研究进展

1.2.1 ABA信号通路的研究进展

1.2.2 ROS的清除机制

1.3 WRKY转录因子的结构、分类

1.4 WRKR家族成员的功能

1.4.1 WRKY转录因子参与调控植物叶片衰老

1.4.2 对代谢的调控

1.4.3 对植物形态建成的调控

1.4.4 对非生物胁迫的调控

1.4.5对生物胁迫的调控

1.5 技术路线

1.6 研究目的及意义

2.1 供试材料

2.1.1 试验材料

2.1.2 载体和菌株

2.1.3 主要药品及试剂配方

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.2.1 GmWRKY16基因组织表达模式分析

2.2.2.2 GmWRKY16基因对逆境胁迫的响应

2.2.3 栽培大豆GmWRKY16 基因的克隆及克隆载体的构建

2.2.3.1 GmWRKY16基因的克隆

2.2.3.2 PCR产物的回收（参照GenStar试剂盒说明书）

2.2.3.3线性化克隆载体

2.2.3.4进行重组反应

2.2.3.5 克隆载体转化大肠杆菌

2.2.3.6 GmWRKY16菌液PCR检测

2.2.4 遗传转化拟南芥及阳性苗的筛选

2.2.5 GmWRKY16的亚细胞定位

2.2.5.1瞬时表达载体的构建

2.2.5.2准备野生型烟草

2.2.5.3瞬时表达

2.2.6 GmWRKY16转录自激活活性验证

2.2.7 转基因拟南芥表型鉴定

2.3 数据统计与分析

2.4 主要生物学软件

3 结果

3.1 GmWRKY16基因的生物信息学分析

3.1.1 GmWRKY16蛋白的结构域分析

3.1.2 GmWRKY16蛋白的同源序列比对及进化树分析

3.3 GmWRKY16基因的表达模式分析

3.3.1 GmWRKY16基因的逆境胁迫响应及表达模式分析

3.3.2 GmWRKY16基因的组织表达量分析

3.4 GmWRKY16基因的克隆

3.5 GmWRKY16基因阳性苗的鉴定

3.6 过表达GmWRKY16基因的纯和T3代拟南芥表型分析

3.6.1过表达GmWRKY16基因的纯和T3代拟南芥在干旱处理下表型分析

3.6.2过表达GmWRKY16基因的纯和T3代拟南芥在NaCl处理下表型分析

3.6.3过表达GmWRKY16基因的纯和T3代拟南芥在ABA处理下表型分析

3.7 GmWRKY16诱导拟南芥干旱相关下游基因的表达

4.1 讨论

4.1.1 GmWRKY16 基因具有调控拟南芥耐旱和耐盐性的功能

4.1.2 GmWRKY16 基因参与气孔的关闭

4.1.3 GmWRKY16诱导拟南芥干旱相关下游基因的表达

4.2 结论

致 谢

参 考 文 献

附 录A

附 录B