异源转化GsMML增强拟南芥耐酸铝功能研究

摘要

铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因子之一。研究发现，植物的转录因子对铝胁迫有响应。本研究从耐铝野生大豆BW69株系中克隆GsMML基因，异源转化拟南芥获得转基因株系，经分子鉴定和耐酸铝表型鉴定，发现GsMML增强了转基因拟南芥对酸铝胁迫的耐受性。
　　本研究主要内容包括：⑴GsMML基因来自野生大豆耐酸铝基因表达谱，基因编号为100805092，GsMML全长序列1213 bp，开放阅读框长726bp，编码241个氨基酸残基。分析蛋白的结构域发现， GsMML蛋白含有2个结构域，其中第2个氨基酸到第77个氨基酸为MADS-box结构域，第81个氨基酸到第169个氨基酸为K-box结构域，推测GsMML蛋白为典型的MADS-box转录因子家族成员。⑵采用Real-time RT-PCR技术研究GsMML基因的组织表达模式，结果表明， GsMML基因在野生大豆BW69的根部表达量最高，显著高于其在茎、叶、花、荚中的表达量。在铝胁迫处理条件下，GsMML基因的表达受酸铝胁迫诱导上调，随着铝浓度的增加，GsMML基因的表达量先逐渐升高后缓慢下降，在AlCl3的浓度为50μM时GsMML基因的表达量达到最高，是对照处理的3倍。从时间进程的角度分析GsMML基因的表达模式，结果表明，未用铝处理时（pH4.3），与对照处理（pH5.8）相比， GsMML基因在处理6 h和12 h的表达量基本没有差异，其相对表达量都接近于1。在酸铝胁迫处理（pH4.3）时，GsMML的表达量随着时间的增加先升高后受到抑制，其中GsMML的表达量在处理6 h时达到最高，最高表达量约为对照处理的3.5倍，而在其它的处理时间点，GsMML的表达量差异不是很大，都接近于对照处理的1-1.5倍。⑶利用重组DNA技术构建融合表达载体pYL322-d1-eGFP-GsMML，将目的基因的编码序列插入到GFP序列的下游，通过PEG介导法将重组载体及空载体转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析，发现GsMML蛋白在细胞核中顺时表达。⑷利用野生大豆BW69克隆得到GsMML基因全长序列，利用重组DNA技术构建植物表达载体pTF101.1-GsMML，异源转化拟南芥获得转化体植株，用草铵膦筛选获得T1代阳性苗。经DNA水平鉴定发现GsMML基因已经整合进拟南芥基因组中；RNA水平鉴定表明，GsMML在不同的拟南芥株系中过量表达。采用酸铝胁迫处理T3代转基因拟南芥，结果表明，在一定的铝浓度下GsMML转基因拟南芥株系的相对根长显著高于野生型，说明转基因拟南芥比野生型具有更强的耐铝性。在50μM AlCl3处理的条件下，GsMML转基因拟南芥株系的游离脯氨酸含量显著高于野生型，且约为野生型的2倍。研究结果表明，GsMML过量表达增强了转基因拟南芥对酸铝胁迫的耐受性。

目录

声明

1 前言

1.1 铝对植物的毒害

1.2 植物耐铝毒机制

1.3 MADS-box转录因子的结构

1.4 MADS-box转录因子的功能

1.5 本研究的目的和意义

1.6 技术路线

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 实验方法

2.3 数据统计与分析

2.4 生物学分析软件

3 结果与分析

3.1 GsMML基因的生物信息学分析

3.2 GsMML基因的表达模式分析

3.3 GsMML蛋白的亚细胞定位分析

3.4 GsMML基因的克隆

3.5 植物表达载体的构建

3.6 GsMML转基因拟南芥株系的鉴定

3.7 GsMML转基因拟南芥耐酸铝表型分析

3.8 GsMML转基因拟南芥脯氨酸含量的测定分析

4.1 讨论

4.2 结论

致谢

参考文献

附录