基于MultiBac多基因表达系统的BmCPV病毒VLPs组装研究

摘要

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）质型多角体病毒属（Cypovirus）。基于近原子分辨率的冷冻电镜三维重构可知，BmCPV衣壳是对称的正20面体，衣壳具有12个顶点，由60个非对称单元组成，每个非对称单元包括核衣壳蛋白（Capsid Shell Protein，CSP）、大型凸起蛋白（Large Protrusion Protein，LPP）以及塔状凸起蛋白（Turret Protein，TP）。BmCPV 无囊膜，单衣壳的特性使之成为国内外冷冻电镜单颗粒三维重构研究的模式材料。　　本研究以 BmCPV的CSP 和 LPP 作为目标蛋白，构建转移载体 pU-CSP-His-mCherry及pF-LPP-His-eGFP，将转移载体pU-CSP-His-mCherry利用Cre-Loxp位点同源重组到AcMultiBac中，同时将转移载体pF-LPP-His-eGFP通过Tn7转座位点转座至AcMultiBac中，获得Ac-rSw106-inv-CSP-His-mCherry、Ac-rSw106-inv-LPP-eGFP以及 Ac-rSw106-inv-CSP-mCherry-LPP-eGFP 重组菌液。使用可表达侵染蛋白的Ac-rSw106-inv-CSP-His-mCherry 、 Ac-rSw106-inv-LPP-eGFP 、 Ac-rSw106-inv-CSP-mCherry-LPP-eGFP重组菌株侵染Sf9细胞，3 d后分别观察到樱桃红色荧光、增强型绿色荧光及两种荧光的共表达。收集上清获得重组病毒Ac-CSP-His-mCherry、Ac-LPP-His-eGFP和Ac-CSP-His-mCherry-LPP-His-eGFP，Western blot检测到目的蛋白相对分子质量所对应的条带，证明 CSP 和 LPP 在 Sf9 细胞中成功表达。将被重组病毒 Ac-CSP-His-mCherry、Ac-CSP-His-mCherry-LPP-His-eGFP感染的Sf9细胞超声破碎，使用蔗糖密度梯度离心纯化分离上清，获得两种不同的VLPs，CSP-VLPs和CSP-LPP-VLPs，透射电子显微镜下可见两种形态良好的VLPs。　　通过对 CPV 病毒结构蛋白的理化性质分析及同源建模，为重组蛋白表达纯化提供了理论依据及参考。同时通过生物信息学分析CPV病毒结构蛋白CSP和LPP的密码子偏爱性，发现上述两种结构蛋白适用于Sf9细胞的表达，但是密码子的使用存在一定的差异性，为后续实验提高CSP和LPP的表达量提供了密码子优化方案。　　通过杆状多基因表达系统表达CSP-VLPs和CSP-LPP-VLPs，为深入解析单衣壳病毒结构提供了良好的理论基础；同时构建好的CSP-LPP-VLPs可以在内部和外部搭载外源分子，可以用于基因治疗投送工具、开发新型生物农药、制备新型的纳米材料、运送RNAi干扰小分子、展示表位多肽等用途，发展前景较好。

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1 前言

1.1.1 BmCPV的生物学特性

1.1.2 BmCPV基因组及其结构学特性

1.2 杆状病毒多基因表达系统概述

1.3 VLPs概述

1.3.1 基于VLPs的预防型疫苗及治疗型疫苗

1.3.2 VLPs作为多功能的运输工具及包装载体

1.3.3 表达VLPs的系统及方式

1.4 本课题研究的内容及意义

1.5 技术路线图

1.

2.1.2 实验常用溶液及试剂的配制

2.1.3 实验所需实验设备及相关试剂

2.2 分子生物学实验方法

2.2.1 引物设计及合成

2.2.2 BmCPV总RNA提取

2.2.3 第一链cDNA合成

2.2.4 CSP和LPP基因的扩增

2.2.5 CSP和LPP基因PCR产物纯化回收

2.2.6 LPP基因的TA克隆

2

2.2.7 转移载体pF-LPP-eGFP和pU-CSP-mCherry构建

2.2.8 双酶切鉴定转移载体pF-LPP-eGFP和pU-CSP-mCherry

2.3 CSP、LPP及CSP-LPP重组菌株的构建

2.4 昆虫细胞培养方法

2.5 侵染蛋白介导的生产感染性重组病毒

2.6 目的蛋白CSP、LPP、CSP-LPP在Sf9细胞表达及检测

2.7 蔗糖密度梯度法纯化两种VLPs

2.7.1 重组杆状病毒侵染Sf9细胞

2.7.2 超声破碎重组病毒侵染的Sf9细胞

2.7.3 两种VLPs蔗糖密度梯度离心

2.8 电镜观察两种VLPs

2.9 生物信息学分析

2.9.1 密码子偏爱性比对

2.9.2 CSP和LPP氨基酸分析

2

3.1 CSP、LPP基因与Sf9细胞密码子偏爱性对比

3

3.3 pU-CSP-His-mCherry和pF-LPP-His-eGFP转移载体的构建

3.4 CSP和LPP蛋白质分析

3.4.1 CSP和LPP蛋白质理化性质分析

3.4.2 CSP和LPP同源建模

3.5 CSP、LPP及CSP-LPP重组菌株的构建

3.6 侵染蛋白介导的生产感染性重组病毒

3.7 CSP、LPP及CSP-LPP的Western blot检测

3.8 两种VLPs的纯化及电镜观察

3.8.1 两种VLP纯化前及纯化后免疫印迹鉴定

3.8.2 两种VLPs的电镜观察

4 讨论与结论

4.1.1 VLPs纯化及电镜结果讨论

4.1.2 CSP和LPP密码子优化方案

4.1.3 CSP与LPP序列分析

4.1.4 杆状病毒多基因表达系统的优势

4.1.5 共组装VLPs前景展望

4.2 结论

致 谢

参 考 文 献

附录