CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗的小鼠免疫效果评估

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的，主要以腹泻、呕吐和脱水为特征，伴有厌食和体重减弱等症状的急性猪肠道传染性病毒病，自流行以来已给全世界养猪产业带来巨大的经济损失。除了生物防控外，疫苗免疫接种是当前防控PEDV感染的主要手段。目前市场上针对该病的疫苗多为灭活苗和弱毒苗，但这些疫苗无法产生足够的黏膜免疫，导致保护效果不理想，同时对目前流行毒株的保护力也不足，因此无法有效地控制该病的区域性流行。针对现有疫苗的不足，研发一种能加强现有疫苗黏膜免疫效果的佐剂，配合现有疫苗使用，以提高现有疫苗整体的免疫效力，这对于防控我国PED疫情具有重要意义。研究已证实霍乱毒素B亚基蛋白（Cholera Toxin B subunit，CTB）能够有效地提升免疫效果，是一种理想的候选黏膜免疫佐剂。本研究以 CTB 蛋白为研究对象，探索了该蛋白在原核表达系统 pET-32a 中的表达和纯化，并将纯化后的CTB蛋白与PEDV灭活疫苗联合使用，在小鼠动物模型上评估了联合使用的免疫方式及免疫效果，主要研究内容如下：　　1. CTB蛋白的原核表达、纯化　　本研究参考GenBank上霍乱毒素基因序列，获得编码的CTB蛋白的基因序列，合成后插入原核表达载体pET-32a中，成功构建了重组质粒pET-32a-CTB，并进一步获得了表达菌。表达菌经 IPTG 诱导表达后，对表达产物进行了 SDS-PAGE 和Western-blot分析和鉴定，结果表明目的蛋白大小约为30 kDa，并且以包涵体形式存在。将包涵体进行变性、纯化和复性的处理，最终获得了纯化且可溶的CTB蛋白。　　2.CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗皮下注射免疫效果的评估　　将CTB蛋白与铝胶等体积预混，再与灭活PEDV进行混合制备成灭活疫苗，按照100μL/每只的剂量皮下注射免疫6周龄SPF BALB/c小鼠，共分为4组：灭活PEDV+铝胶+CTB组、灭活PEDV+铝胶组、CTB组和PBS对照组，免疫2次，间隔1周。于第4周至第9周每周随机挑选三只小鼠采血检测血清中IgG抗体水平及中和抗体水平，第7周至第9周随机挑选三只小鼠采集肠组织检测IgA抗体水平及中和抗体水平。　　CTB蛋白联合 PEDV灭活疫苗通过皮下注射免疫小鼠。检测血清 IgG抗体水平及血清中和抗体效价（49 d）的结果表明，CTB蛋白能够有效提升小鼠血清PEDV特异性 IgG 抗体水平，与其他组相比表现出极显著差异（P＜0.01），同时血清中和抗体水平为1:113.3，也显著高于其他组（P＜0.05），小鼠肠组织IgA抗体的检测结果表明各组肠组织IgA水平差异不大。　　3. CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗口服免疫效果的探索　　PEDV是以肠道黏膜入侵为主的病毒，因此我们不但需要能够诱导怀孕母猪产生一定的全身性免疫，同时还需要能诱导其产生足够的黏膜免疫使新生仔猪获得母源sIgA抗体，因此本研究探索了CTB蛋白联合PEDV灭活疫苗口服免疫的可能性。将CTB蛋白与0.4%壳聚糖等体积预混，再与灭活PEDV进行混合制备成口服灭活疫苗，按照100μL/每只的剂量口服免疫6周龄SPF BALB/c小鼠，共分为4组：灭活PEDV+0.4%壳聚糖+CTB组、灭活PEDV+0.4%壳聚糖组、0.4%壳聚糖组和PBS对照组，免疫程序及检测指标与上述皮下注射相同。　　口服免疫小鼠后，经血清IgG抗体水平及肠组织IgA抗体水平检测分析表明，CTB蛋白能够有效提升小鼠血清PEDV特异性IgG抗体水平，与其他组相比在49 d表现出极显著差异（P＜0.01），同时49 d血清中和抗体水平为1:56.18，显著高于其他组（P＜0.05）。小鼠肠组织IgA抗体在49 d及56 d时与其他组对比差异极显著（P＜0.01），并且肠组织中和抗体水平为1:33.6，相比对照组也表现极显著差异（P＜0.01）。以上结果表明CTB蛋白与灭活PEDV联合口服免疫时，能够刺激小鼠产生局部黏膜免疫和全身免疫。　　本研究探索了黏膜免疫佐剂CTB蛋白，与PEDV灭活疫苗联合使用，通过皮下免疫及口服免疫的方式提升了小鼠血清 IgG 抗体和小鼠肠道 IgA 抗体，有效地增强抗原的全身及局部黏膜反应，从而提升了PEDV灭活疫苗的免疫效果。

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1 前言

1.1 病原学研究

1.1.1 冠状病毒及PEDV病毒学分类

1.1.2 PEDV的形态和理化特性

1.1.3 PEDV的分子生物学特性

1.1.4 PEDV的致病机理

1.1.5 PEDV流行病学研究

1.1.6 PEDV细胞培养特性

1.2 肠道黏膜免疫

1.2.1 肠道黏膜免疫的组成及功能

1.2.2 黏膜疫苗

1.2.3 霍乱毒素B亚基蛋白

1.3 PEDV的防控和疫苗研究进展

1.3.1 PEDV的防控

1.3.2 传统疫苗

1.3.3 新型疫苗

1.4 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种、毒株、细胞和质粒

2.1.2 试验动物

2.1.3 主要仪器和设备

2.1.4 主要试剂

2.1.5 常用试剂的配制

2.2 方法

2.2.1 目的基因的获得及载体的构建

2.2.2 重组表达载体的构建

2.2.3 重组表达菌的构建及最佳诱导条件的探索

2.2.4 重组CTB蛋白的表达分析及Western-blot鉴定

2.2.5 重组CTB蛋白的制备及纯化条件的探索

2.2.6 重组CTB蛋白浓度测定与处理

2.2.7 PEDV的培养与灭活

2.2.8 PEDV注射灭活疫苗的制备

2.2.9 PEDV注射灭活免疫小鼠效果评估

2.2.10 PEDV口服灭活疫苗的制备

2.2.11 PEDV口服免疫小鼠效果评估

2.2.12 血清及肠组织样品的收集及处理

2.2.13 PEDV特异性IgG抗体间接ELSIA检测方法的建立

2.2.14 小鼠血清PEDV特异性IgG抗体水平检测

2.2.15 小鼠肠组织PEDV特异性IgA抗体水平检测

2.2.16 血清中和抗体水平检测

2.2.17 肠组织中和抗体水平检测

2.2.18 数据统计

2.3 结果

2.3.1 重组表达质粒酶切鉴定及测序结果

2.3.2 重组CTB蛋白的表达条件的探索

2.3.3 重组CTB蛋白的可溶性分析

2.3.4 重组CTB蛋白的Western-blot鉴定

2.3.5 重组CTB蛋白变性效果的验证

2.3.6 重组CTB蛋白纯化条件的探索

2.3.7 重组CTB蛋白纯化效果验证

2.3.8 PEDV特异性IgG抗体间接ELSIA检测方法最佳条件的确立

2.3.9 注射免疫组PEDV特异性IgG/IgA抗体水平检测结果

2.3.10 口服免疫组PEDV特异性IgG/IgA抗体水平检测结果

2.3.11 小鼠血清PEDV中和抗体水平结果

2.3.12 小鼠肠组织PEDV中和抗体水平结果

3 讨论

3.1 重组CTB蛋白的原核表达与纯化

3.2 重组CTB蛋白配合PEDV灭活疫苗的小鼠免疫效果评估

4 总结

致 谢

参考文献

附录