杂交鳢抗病microRNA发掘及罗非鱼微生态无抗养殖体系构建

摘要

无抗养殖是在水产品质量安全背景下产生的一种新的养殖观念，其目的是减少抗生素在水产养殖中的使用，保障人类安全。在食品安全事件频发、水产品质量安全概念为大众广泛接受的背景下，无抗养殖已经成为养殖领域的发展趋势和研究热点。本论文通过对杂交鳢（Channa maculata♀× Channa argus♂）抗病microRNA（miRNA）发掘和吉富罗非鱼（GIFT Oreochromis niloticus）微生态无抗养殖体系构建研究，关注水产品质量安全，为实现无抗养殖提供新思路。论文分为两个部分：　　第一部分 杂交鳢抗病miRNA发掘　　以杂交鳢为研究对象，通过检测水产常见致病菌感染前后杂交鳢脾脏miRNA表达谱的变化筛选差异表达miRNA，寻找杂交鳢抗细菌感染过程中起重要作用的调控因子，为鱼类免疫机制研究和抗病种质的开发提供参考资料。实验选取平均体重为30 ±0.75g的杂交鳢40尾，随机分成两组，分别腹腔注射PBS溶液和四种水产常见致病菌（嗜水气单胞菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、链球菌）混合液（107cfu/mL）0.1ml/尾， 24h后采集脾脏样品。对杂交鳢脾脏样品进行miRNA表达谱测序和生物信息学分析，结果发现差异表达miRNA 828个（包括新预测的miRNA 23个）， 其中上调546个，下调274个，上调miRNA为下调miRNA的1.99倍；另外8个测序数量有差异，总体差异很小。四种致病菌感染杂交鳢后可以显著上调脾脏中miR-30d、miR-489、miR-212、miR-216b、miR-96、miR-103等miRNA的表达，下调miR-196a、miR-125b、miR-15a、miR-216b、miR-205等miRNA的表达。对已知差异表达的miRNA候选靶基因进行GO和KEGG富集分析表明，参与传染性疾病（病毒、细菌和寄生虫）相关的靶基因274个，参与免疫系统和信号传导系统的靶基因分别为112和103个基因，参与消化系统的靶基因161个基因。本研究表明miRNA在杂交鳢脾脏免疫抗病过程中发挥重要调控作用。　　第二部分 罗非鱼微生态无抗养殖体系构建　　通过构建吉富罗非鱼与空心菜微生态复合养殖体系，探索鱼菜微生态循环养殖在实现无抗养殖中应用的可行性。试验分为对照组和试验组，每组设3个重复，选择个体健壮，体态均匀的罗非鱼360尾（平均体重30.7±0.37g），随机平均分配到6套养殖系统中，试验组种植空心菜，对照组不种菜，试验全程饲喂基础饲料，试验过程不进行换水排污操作，只补充因蒸发损失的水量，养殖周期为42d。试验过程中每周采集水样、罗非鱼和空心菜样品，对养殖水体水质指标，罗非鱼生长性能、体成分、鱼体抗氧化性能及ACP和AKP、空心菜生长性能进行测定，综合评价该微生态无抗养殖体系的实际应用效果。研究结果表明：1. 微生态养殖体系可以净化养殖水体，水体中氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐含量呈先上升后下降趋势，净化水质效果明显。2. 微生态养殖体系有利于罗非鱼的养殖，实验组罗非鱼成活率达到96％以上，而对照组由于水质原因第二周出现大批死亡；该养殖体系有利于提高罗非鱼抗氧化和免疫能力，其中罗非鱼血清和肝脏中SOD、T-AOC、 ACP、AKP随着时间的增加而显著提高（P＜0.05），血清MDA含量逐渐降低。3.微生态养殖体系有利于空心菜的种植，空心菜枝干强壮，菜叶茂盛，成活率高达98.35%，单株平均重量77.14g，生长状况良好。

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摘 要

第一部分 杂交鳢抗病调控microRNA发掘

1 前言

1.1鱼类miRNA研究进展

1.2 杂交鳢简介

1.3 鱼类的细菌性病害研究

伴随着集约化、工厂化养殖规模的不断扩大，养殖密度也迅速增加，导致水体环境逐渐发生恶化，鳢科鱼类病害频

1.4 鱼类免疫抗病相关基因的研究

1.5 抗病相关基因在鱼类育种中的应用

1.6 研究目的和意义

2.1 试验材料

2.2 四种致病菌攻毒注射试验

（1）菌液制备

（2）攻毒实验

2.3 样品总RNA的提取及质量检测

2.3.2 样品总RNA的质量检测

2.4 Solexa高通量测序

2.5 小RNA文库生物信息学分析流程

2.6 样品总测序数据处理与分析

2.6.1小RNA分类与预测

2.6.2 靶基因预测

2.7 层次聚类分析

2.8 Pathway显著性富集分析

3 结果与分析

3.1 测序总量及测序质量

3.2 各碱基测序质量及片段长度统计

3.3 测序片段与参考基因组比对

3.5小RNA预测

3.6 miRNA靶基因预测

3.7 差异表达miRNA筛选

3.8差异表达的小RNA热图聚类

3.9 差异小RNA的靶基因预测与分析

3.9.1 差异小RNA的靶基因GO显著性富集分析

3.9.2 差异小RNA的靶基因Pathway显著性富集分析

4 讨论

5 小结

（2）对杂交鳢四种致病菌混合感染前后脾脏组织中差异表达的已知miRNAs、差异表达的新miRNAs进

第二部分 微生态无抗养殖体系构建

1前言

1.1我国水产养殖业发展现状

1.2 鱼菜共生机理

1.3 鱼菜共生主要类型

1.4 鱼菜共生养殖模式发展现状

1.5 构建微生态无抗循环养殖系统必要性

1.6 研究目的和意义·

2.1 试验材料

2.1.1 罗非鱼

2.1.2 空心菜菜苗

2.1.3微生态无抗养殖系统构建

2.1.4 试验饲料

2.1.5 主要试验仪器设备

2.2 试验设计与分组

2.3 饲养管理

2.4 样品采集及处理

2.4.1 水样采集

2.4.2 罗非鱼样品采集

2.4.3 空心菜样品采集

2.5 试验方法

水体中pH、氨氮、溶解氧、亚硝酸盐、磷酸盐含量测定均使用盘天生物PTF-001B多参数水质检测仪进行

2.5.2罗非鱼各项指标测定

每缸3尾鱼进行称重，并在冷冻干燥仪中干燥至恒重，检测鱼体水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量。水分含量采

2.5.3 空心菜生长指标的测定

2.6 试验数据分析

3 结果与分析

3.1微生态无抗养殖系统中水质变化情况

3.2 微生态无抗养殖系统中罗非鱼相关指标

3.2.1微生态无抗养殖系统中罗非鱼的生长性能

3.2.2微生态无抗养殖系统中罗非鱼全鱼体成分

3.2.3 微生态无抗养殖系统中罗非鱼抗氧化及免疫指标的影响

由表10可见，肝脏SOD活性随着时间增加而增加，第14d、21d、28d肝脏SOD活性与第0d相比显

3.3 微生态无抗养殖系统中空心菜生长性能

微生态无抗养殖系统中空心菜图片如图16所示，由表11结果显示可知，选取81株初始均重8.2±0.08

图17 微生态无抗养殖系统中空心菜图片

4 讨论

4.1微生态无抗养殖系统对水质的影响

4.2 微生态无抗养殖系统对罗非鱼的影响

水质的好坏与对水产养殖的产量和质量息息相关，当养殖水体污染严重时，亚硝酸盐、氨氮的含量会明显增加，对

4.2.2 微生态无抗养殖系统对罗非鱼抗氧化及免疫指标的影响

4.3 微生态无抗养殖系统对空心菜的影响

5 小结

结 论

致 谢

参 考 文 献

附录