斑点叉尾鮰抗病免疫相关microRNA的发掘及功能预测

摘要

MicroRNA（miRNA）是一类在动植物体中广泛存在的内源性非编码小RNA分子。miRNA主要参与基因转录后水平的调控，在生物体发育、细胞活动、免疫功能调控及疾病发生等许多生命活动过程中发挥着重要调控作用。人和动物miRNA的研究报道较多，且日渐深入；鱼类作为重要的脊椎动物，其miRNA的研究报道较少，尤其miRNA在抗病免疫调控功能方面的研究更少。为了研究鱼类miRNA在免疫调控中的作用，本论文以在硬骨鱼类免疫系统中具有较高代表性的斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）为实验动物，首先研究了免疫刺激剂脂多糖（LPS）及β-葡聚糖处理下斑点叉尾鮰免疫组织中9个免疫相关miRNA及6个细胞因子的表达变化；在此基础上，通过二代高通量测序和生物信息学分析，构建了拟态弧菌感染前后斑点叉尾鮰免疫组织中miRNA表达谱，并对差异表达的miRNA进行了功能预测。研究结果不仅对深入了解miRNA的抗病免疫调控功能具有参考价值，并为后续miRNA功能研究奠定良好基础。本论文实验分为两个部分：
　　一、LPS和β-葡聚糖免疫刺激下斑点叉尾鮰免疫相关miRNA及细胞因子表达差异
　　选取平均体重为18.48±0.20 g的斑点叉尾鮰40尾，随机分成两组，分别腹腔注射PBS溶液和LPS溶液（5 mg/ml）0.1 ml/尾，24 h后采集斑点叉尾鮰主要免疫器官肝脏、头肾、脾脏样品；选取平均体重为2.20±0.02 g的斑点叉尾鮰240尾，随机分成两组，分别投喂基础饲料及添加β-葡聚糖（1 g/kg）的基础饲料，进行为期30天的投喂实验，试验后采集斑点叉尾鮰主要免疫器官肝脏、头肾、脾脏样品。将采集的斑点叉尾鮰主要免疫器官肝脏、头肾、脾脏样品，液氮速冻，提取总 RNA，反转录之后通过荧光定量PCR对三个组织中的9个已知的免疫相关miRNA及6个免疫相关的细胞因子进行研究。结果表明，9个免疫相关 miRNA在肝脏、头肾、脾脏一个或几个组织中差异表达显著，且主要是表达上调，但LPS处理引起的miRNA的表达变化更大。6个细胞因子在肝脏、头肾、脾脏一个或几个组织中都差异表达，β-葡聚糖刺激引起的表达主要是下调的，而LPS引起的表达主要呈上调的。
　　二、拟态弧菌感染前后斑点叉尾鮰miRNA表达谱构建及靶基因分析
　　选取平均体重为170.08±23.75 g的斑点叉尾鮰80尾，随机分成两组，分别腹腔注射PBS溶液和拟态弧菌菌液（6.78×107个/ml）0.1 ml/尾，48 h后采集头肾、脾脏组织样品液氮速冻，-80℃保存。对样品分别提取总RNA，检测质量合格后反转录成cDNA，然后通过Hiseq高通量测序技术及生物信息学分析，构建了斑点叉尾鮰拟态弧菌感染前后头肾、脾脏组织的四个cDNA文库。以近缘物种墨西哥脂鲤（Astyanaxmexicanus）基因组为参考基因组，对测序reads进行分类注释，并与miRBase数据库收录的全部动物已知miRNA进行比对，在感染前后头肾组织中分别鉴定了1504和1658个保守的miRNA及25和27个新miRNA；在感染前后的脾脏组织中分别鉴定了1407和1258个保守的miRNA及23和15个新miRNA。通过expdiff方法对感染前后miRNA表达水平进行比较，结果发现，拟态弧菌感染导致头肾中502个保守的和10个新的miRNA差异表达；而在脾脏组织中有281个保守的和6个新的miRNA差异表达。我们对这些差异表达的保守miRNA及新的miRNA进行靶基因预测分析，并对获得的靶基因进行了功能分类富集和代谢通路分析，发现多个靶基因富集在抗病免疫相关的通路中。
　　结论：研究结果表明9个免疫相关miRNA可能在斑点叉尾鮰LPS和β-葡聚糖刺激引起的免疫应答中发挥了重要的调节作用。IL-1，TNF-α，IFN-γ和TLR2等细胞因子可能参与miRNA的免疫调节过程。斑点叉尾鮰被拟态弧菌感染后头肾、脾脏组织中miRNA表达差异明显，差异表达的miRNA靶基因主要富集在抗病免疫相关的通路中。本论文为鱼类免疫相关miRNA的研究提供基础数据，同时为深入研究miRNA在鱼类免疫调控中的作用机理奠定了基础。

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第一章 前言

1.1 斑点叉尾鮰简介

1.2 miRNA简介

1.2.1 miRNA概况

1.2.2 miRNA产生机制

1.2.3 miRNA检测方法

1.2.4 miRNA在人和动物抗病免疫方面的研究

1.3 鱼类miRNA研究进展

1.3.1 鱼类miRNA的寻找及鉴定

1.3.2 鱼类免疫相关miRNA研究

1.4 研究目的及意义

第二章 斑点叉尾鮰已知免疫相关miRNA及细胞因子的表达变化

2.1 前言

2.2 实验材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 样品采集

2.2.3 样品总RNA的提取及质量检测

2.2.4 组织中miRNA鉴定及表达

2.2.5 组织中免疫相关细胞因子的表达

2.2.6 数据处理与统计

2.3 结果与分析

2.3.1 样品总RNA质量检测

2.3.2 各组织样品的miRNA的鉴定及表达

2.3.3 各组织中免疫因子的表达情况

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 拟态弧菌感染前后斑点叉尾鮰miRNA表达谱构建及生物信息学分析

3.1 前言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 拟态弧菌攻毒实验

3.2.3 样品总RNA的提取及质量检测

3.2.4 Solexa高通量测序

3.2.5 小RNA文库生物信息学分析流程

3.2.6 数据处理及小RNA文库质量评估

3.2.7 标准信息分析

3.2.8 已知miRNA分析

3.2.9 新miRNA分析

3.2.10 统计分析

3.3 结果与分析

3.3.1 拟态弧菌感染斑点叉尾鮰实验

3.3.2 总RNA质量

3.3.3 Solexa测序结果分析

3.3.4 标准信息分析

3.3.5 已知miRNA分析

3.3.6 新miRNA分析

3.4 讨论

3.4.1 拟态弧菌攻毒斑点叉尾鮰半致死浓度的确定

3.4.2 小RNA文库的生物信息学分析

3.4.3 显著性差异表达miRNA对鱼类免疫调控的影响

3.5 小结

全文结论

致谢

参考文献

附录