霸王花腐烂病致病菌毒素的初步研究

摘要

植物病原真菌除草剂就是利用致病菌及代谢产物作为活性物质防除杂草，具有易培养、生产条件易人为控制、经济又高效、不会引起“3R”问题、对生态环境无污染等优点，越来越受世界各国的关注。胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）BWH-1和双间柱顶孢（Neoscytlidium dimidiatum）BWH-3是从霸王花腐烂病为害茎上分离得到的致病菌株，本论文以胶孢炭疽菌BWH-1为主要研究材料，对该病原菌代谢产物的提取、对霸王花和芦荟的致病机制、对 18 种杂草的致病活性及毒素稳定性进行了初步研究，并对BWH-1 菌株的产毒条件进行了初步的优化，以期探明其代谢物作为生物除草剂的可能性。　　BWH-1菌株和BWH-3菌株培养液经无菌过滤后，将滤液分别针刺注入霸王花茎发现：BWH-1菌株液体培养物具有致霸王花腐烂特性，而BWH-3菌株培养物不能致霸王花腐烂。采取不同有机溶剂对 BWH-1 菌株发酵滤液进行提取或去蛋白试验，生测表明 BWH-1 菌株发酵滤液乙酸乙酯萃取物（粗毒素）致病活性最高，其发病症状与毒素原液的病症相同。显微观察结果表明BWH-1菌株毒素滤液对霸王花茎部栅栏组织、海绵组织和维管束组织有破坏作用，导致细胞破裂严重损伤；芦荟叶部组织试验表明，BWH-1菌株毒素也能导致芦荟叶片组织细胞破裂，与霸王花茎部损伤相似。　　BWH-1菌株毒素滤液稳定性试验结果表明：BWH-1菌株毒素滤液对外界环境具有较好的稳定性，在30~80℃温度条件下稳定，90~100℃处理60 min其活性丧失；在pH 为3~9.5 条件下其活性稳定，强碱条件下，毒素活性大幅度消弱；耐受紫外线照射。　　采用种子萌发抑制法对青葙(Celosia argenteaL.)、胜红蓟(Ageratum conyzoidesL.)、牛筋草(Eleusine indicaL.Gaertn)、三叶鬼针草(Bidens pilosaL.)、马唐(Digitaria sanguinalis)、薇甘菊(Mikania micranthaKunth)、反枝苋(Amaranthus retroflexusL.)、稗草(Echinochloa crusgalliL.Beauv)8种杂种子用不同浓度毒素进行处理，结果表明各浓度毒素对杂草种子萌发均有抑制作用，粗毒素浓度越高抑制效果越好，在粗毒素为0.4 mg/mL时对8种杂草种子萌发抑制率分别为60.8%、71.96%、49.94%、80.12%、42.02%、49.28%、75.62%和52.97%。采用根茎生长抑制法对三叶鬼针草、稗草、苘麻(Abutilon theophrastiMedicus)、牛筋草、胜红蓟、反枝苋、小藜（Chenopodium serotinumL.）、青葙、车前草（Plantago asiaticaL.）、薇甘菊10种杂草用不同浓度毒素处理，结果显示毒素对供试杂草的根茎有抑制生长作用，在粗毒素为0.4 mg/mL 时对10 种杂草根生长抑制率分别为81.07%、66.74%、52.01%、58.78%、75.79%、75.12%、53.22%、62.07%、75.02%、54.91%和对茎生长抑制抑制率分别为75.17%、61.46%、47.5%、51.93%、63.69%、71.19%、46.18%、65.5%、72.51%、47.5%。并且毒素浓度较高时，可使杂草根茎变色发黑，病变腐烂。离体叶片针刺法对落葵薯(Anredera cordifolia(Tenore) Steenis)、薇甘菊、竹叶草(Armgrass)、野芋(Typhonium giganteumEngl.)、空心莲子草(Alternanthera Philoxeroides(Mart.) Griseb)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis(Osbeck.) Merr.)、落地生根(Bryophyllum pinnatum(Lam.) Oken)、凤眼蓝(Eichhornia crassipes(Mart.) Solms)8 种杂草进行不同浓度毒素的生物活性测定，试验结果表明：粗毒素浓度高于0.1 mg/ml时致病力较强，腐烂病斑明显，尤其对凤眼莲、落地生根等杂草致病性明显，致病斑直径大小在5.8 mm以上，粗毒素浓度小于0.05 mg/ml致病力稍弱。用0.1mg/ml粗毒素针刺上述8种杂草叶片，在不同时间段测定病斑大小，以确定不同处理时间对供试杂草的致病性，结果表明处理7 d时，上述杂草病斑大小分别为6.8mm、5.5 mm、4.8 mm、6.2 mm、6.3mm、5.7 mm、7.7 mm、7.4 mm。　　对 BWH-1 菌株液体发酵培养基的产毒条件进行了碳源、氮源、培养基 pH 等单因素优化试验，优化了培养基组成，优化后的培养基组成为：C 源为蔗糖、N 源为NaNO3、pH为6.5。添加霸王花茎浸汁试验表明，添加5%的霸王花茎浸汁能提高BWH-1菌株发酵液毒素滤液生物活性。　　以培养时间、接种量、温度和培养基起始pH值为因素，通过正交试验进一步优化产毒条件，筛选BWH-1菌株最佳产毒培养条件为：培养时间8 d、温度28℃、pH6.5和接种量4块/100 mL。在最佳培养条件下，BWH-1菌株毒素滤液对三叶鬼针草幼根的抑制率为53.46%，比优化前对三叶鬼针草幼根的抑制作用提高了9.85%。

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