低粘附培养法体外构建三维预血管化成骨细胞微球

摘要

目的：通过将兔骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells， BMSCs)、兔骨髓间充干细胞诱导分化形成的成骨细胞(osteoblast cells，OBs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)体外共培养，用低粘附培养法构建预血管化三维细胞微球，为血管化组织工程骨的构建提供一种新的策略。　　方法：（1）兔骨髓间充质干细胞的体外分离和培养：采用全骨髓贴壁法分离、培养、纯化细胞，倒置显微镜下观察细胞形态、增殖情况，拍照记录。（2）兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向的诱导分化：将第2代的兔骨髓间充质干细胞用含成骨诱导剂的培养基连续培养14天，倒置显微镜下观察细胞形态、增殖状况，茜素红染色鉴定成骨细胞。（3）人脐静脉内皮细胞的培养：观察细胞形态、增殖情况，拍照记录。（4）BMSCs细胞微球的构建：细胞悬液以1000个/孔、5000个/孔、10000个/孔、50000个/孔的接种密度接种在超低粘附96孔U型培养板中构建BMSCs微球，接种后的第1,3,7天在显微镜下观察并测量微球直径大小，探索微球大小与细胞接种数量的关系。（5）共培养细胞微球的构建：以 50000 个/孔的细胞接种密度分别形成 BMSCs 微球，OBs 微球，三种细胞共培养微球（BMSCs：OBs：HUVECs=1:1:1），观察细胞微球形成的过程。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色，检测微球的成骨分化；CD31和DAPI免疫荧光染色和组织学检测，观察细胞微球内微血管官腔结构的形成情况。　　结果：（1）采用全骨髓贴壁法提取的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形、多角形克隆样生长。（2）BMSCs在成骨诱导剂的作用下，连续诱导14天的茜素红染色结果为阳性，可以观察到橙红色矿化结节。（3）人脐静脉内皮细胞增殖良好，显微镜下的形态特征呈“铺路石样”（4）BMSCs细胞悬液接种于超低粘附U型96孔板后，24h内细胞聚集形成微球，微球直径大小与细胞数量成正比。微球直径随时间的推移逐渐变小，微球聚合更加紧密（5）以50000个/孔的细胞接种密度分别形成的BMSCs微球，OBs微球和共培养微球（BMSCs∶OBs∶HUVECs=1∶1∶1）， OBs微球直径最小，聚合最紧密；共培养组微球周围细胞排列较松散；微球体外培养到第7天的碱性磷酸酶检测（ALP）和茜素红检测结果表明，成骨微球和共培养微球染色结果呈阳性。第1,3,7天进行的CD31染色，免疫荧光染色镜下可以观察到共培养组微球中HUVEC迁移、聚集、进行性管腔形成的过程。　　结论：BMSCs 在一定条件下可以向成骨细胞方向诱导分化；将 BMSCs、BMSCs向成骨细胞方向诱导分化形成的OBs和HUVECs三种细胞共培养，可以体外构建具有血管网络结构的预血管化成骨微球，为血管化骨组织工程的构建提供了一种新的策略。

目录

声明

附录 中英文缩写词表

第一章 前言

第二章 绪论

2.1 MSC微球的研究进展及应用前景

2.2 三维细胞微球在预血管化组织工程方面的研究及应用

第三章 BMSCs细胞微球的体外构建及直径大小探索

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器和设备

3.2 实验方法

3.2.1 兔BMSCs的体外分离、培养与鉴定

3.2.2 兔BMSCs微球的构建及直径大小测量

3.2.3 统计学分析

3.3 实验结果

3.3.1 兔BMSCs的形态学特征

3.3.2 BMSCs细胞微球及直径大小

3.4 实验讨论

第四章 预血管化成骨细胞微球的体外构建

4.1 实验材料

4.1.1 细胞及试剂

4.1.2 实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 细胞培养

4.2.2 预血管化成骨细胞微球的构建

4.2.3 微球的HE染色

4.2.4 微球的成骨检测

4.2.5 微球的成血管检测

4.3 实验结果

4.3.1 BMSCs、OBs和HUVECs的形态学特征

4.3.2 预血管化成骨细胞微球的形态观察

4.3.3 微球的HE染色结果

4.3.4 微球的成骨检测结果

4.3.5 微球的成血管检测结果

4.4 实验讨论

第五章 结论与展望

主要结论

研究展望

参考文献

在学期间的研究成果

致谢

临床病例 成人唇腭裂患者一例