正常小鼠减重法测定rhvCNTF生物活性的方法学研究

摘要

睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)最初是从鸡的睫状神经节中提取出来的，对神经细胞的生长、分化具有明显的营养作用。在进行治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的临床试验时发现CNTF还有治疗肥胖和糖尿病的药用价值。传统的CNTF的生物活性测定方法，主要有鸡胚背根神经节法和睫状神经节法，这些方法是基于CNTF有促进神经元生长和分化的作用建立的，但是，在体外细胞培养模型中，CNTF的量效关系通常呈现为全或无式，很难对其活性进行定量评价。以CNTF调节体内能量平衡的活性为理论基础，建立新的活性测定方法，将更有助于预测该类药的减肥活性或筛选CNTF减肥活性异构体，并对产品质量进行控制。 本实验通过考察不同动物种属、不同体重、不同给药途径、连续给药时间等条件下rhCNTF类似物对动物体重、摄食量、血糖浓度及脂肪指数的影响，摸索出了一套简单易行、重复性好，有明显量-效关系、可用来考察rhCNTF及其类似物活性的测定方法，该方法可用于rhvCNTF类药物减肥活性的预测、产品质量控制、动物实验时血清中抗rhvCNTF类药物的中和抗体的检测。 一、动物种属的选择和检测方法的建立以SD大鼠、金黄地鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6J小鼠、NIH小鼠及昆明种小鼠作为受试动物，试验分为空白对照组、阳性对照组和给药组，受试药sc.2次/日，连续给药10天，以体重增长率为检测指标，观察受试药对小鼠体重增长的影响。结果表明，检品对BALB/C小鼠、C57BL/6J小鼠体重增长无明显抑制作用，但能显著抑制SD大鼠、金黄地鼠、NIH小鼠和昆明种小鼠的体重增长；而且发现昆明种小鼠体重增长幅度最大，对受试药的反应最为敏感，是可用于CNTF类药生物活性测定的较好的实验动物，进一步的实验选用昆明种小鼠，对各种影响因素进行了评价。将体重20g、25g、30g、35g的昆明小鼠分为四个实验组，每组一半的作为空白对照组，另一半作为给药组，重组人睫状神经营养因子突体(C-16)剂量500μ/kg·d-1，连续给药10天，观察C-16对小鼠体重、摄食量和脂肪指数的影响。结果，各体重给药组动物体重均较空白对照组减少，且差别有显著性意义(P<0.01)，其中以20g两组差异最为明显；摄食量除20g受试组较对照组减少且有显著性差异(P=0.0067)外，其他各组均无显性差异；给药组脂肪指数均较空白对照组下降且差别有显著性意义(P<0.01)，其中以35g给药组体脂减少最为明显。 选择20g雄性昆明小鼠，C-16 250μg/kg·d-1剂量，分别以sc、im、ip途径给药，观察不同途径给药对小鼠体重、摄食量、血糖浓度、脂肪指数的影响。结果C-16 sc组体重与空白对照组(NS.ip)无显著性差异，C-16ip组与im组体重、体脂明显低于空白对照组且差别有显著性，以C-16 ip作用最强；各种给药途径对小鼠摄食量均无明显影响；各给药途径C-16组小鼠血糖均有所降低，但只有im组与空白对照组比差异有显著性。 选择20g雄性小鼠分组，分为空白对照、C-16 4、8、16、31.3、62.5、125、250和500μg/kg·d-1，ip，观察药物对小鼠体重、摄食量、血糖浓度、脂肪指数的影响。结果，C-16 4-16μg/kg·d-1虽可使小鼠体重下降，但和空白对照组比差异不显著，C-16其他各剂组小鼠体重明均明显下降，与空白对照组均有显著性差异。C-16对小鼠给药5d、8d、10d ED50分别为145.0、136.0、125.5μg/kg·d-1。C-16 4、8、16、31.3、62.5、125、250、500μg/kg·d-1给药5d时的体重增长抑制率分别为0.84、23.8、24.1、25.9、27.8、31.4、57.8和74.0％；给药10d时分别为-3.4、21.5、17.9、29.7、22.6、28.6、51.1和57.9％。体重增长抑制率以5d时最高，线性范围为31.3-500μg/kg·d-1，最小有效量为31.3μg/kg·d-1。不同剂量的C-16在给药全程中对小鼠摄食量无明显影响；受试组小鼠血糖浓度均低于空白对照组，但仅C-16 32μg/kg·d-1组有显著性差异；随着C-16剂量增大，脂肪指数呈下降趋势，高剂量组(125、250、500μg/kg·d-1)小鼠脂肪指数与空白对照组有显著性差异，其他各组与空白对照组差异无显著性。 实验结果表明，在用正常小鼠减重法进行rhCNTF类药物生物活性检定时，选起始体重为20g的昆明种小鼠，药物剂量范围为32-500μg/kg·d-1剂量，以倍数递增剂量，一日量分两次给予，ip，连续给药5天，0d-5d每日定时称体重，计算体重变化率、体重增长抑制率，计算药物的ED50°即可较稳定地测定该类药的生物活性。 二、方法可重复性的验证研究用已确定的方法对C-16变构体的生物活性重复测定3次。选用18-20g昆明种小鼠，分为NS、C-16 32、62.5、125、250、500μg/kg·d-1和标准品250μg/kg·d-1、原液250μg/kg·d-1各剂量组，ip，连续给药5天，观察小鼠体重、体重变化率、体重增长抑制率、计算C-16的ED50°实验连续重复三批。 结果5d时各给药组和对照组相比，差异均有显著性，量效关系明显；标准品组250μg/kg·d-1与成品250μg/kg·d-1组体重增长抑制无明显差别：原液250μg/kg·d-1对小鼠体重增加的抑制作用强于同剂量成品，但两组体重增长抑制率无显著性差别(P>0.05)。三批实验表明，本法检测灵敏度为C-16 32μ/kg·d-1，药物有效剂量的线性范围为32-500μg/kg·d-1，方法的变异系数为17.9％(ED50±SD=61.9±11.1)，同批产品三批实验测得的ED50分别是66.45、49.06和69.58μg/kg·d-1，ED50重复性良好，可较稳定地测定该类药的生物活性。 结论：可用20g起始体重的正常雄性昆明种小鼠对C-16进行生物活性检定，该法量效关系明确、灵敏度高、变异系数小，重复性高，实验周期短，可用于rhvCNTF类药物的生物活性检定。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分不同种属动物对rhvCNTF的敏感性研究

材料

1药品和试剂

2动物

3仪器

方法

1不同种属动物对C-16敏感性研究

2不同给药途径对C-16减重活性影响的研究

3小鼠起始体重对C-16减重活性的影响研究

4 C-16减重活性的量效关系研究

结果

1不同种属动物对C-16敏感性研究结果

2给药途径对C-16活性检测结果的影响

3小鼠起始体重对C-16减重活性的影响

4 C-16活性检测的量效关系研究

讨论

1不同种属动物对C-16的敏感性

2给药途径对C-16减重活性的影响

3小鼠起始体重对C-16减重活性的影响

4 C-16活性检测的量效关系

第二部分正常小鼠减重法对CNTF变构体生物活性测定的方法学验证

材料

1.药品和试剂

2.动物

3.仪器

方法

1分组与给药

2减重作用测定流程

3测定指标：

结果

1实验一

2实验二

3实验三

4三批重复实验结果

讨论

参考文献

致谢