福建柏响应盐胁迫差异蛋白分析

摘要

福建柏(Fokienia hodginsii)是柏科(Cupressaceae)福建柏属(Fokienia)常绿乔木，国家Ⅱ级保护植物，为福建省珍稀乡土树种，福建柏树形优美似宝塔状，木材材质优良，且具有耐瘠薄的生长特性。盐害是植物最主要的非生物胁迫因子之一，影响着福建柏的生长与分布。利用蛋白质组学的研究方法，对福建柏响应盐胁迫相关蛋白进行分析，对于福建柏的耐盐机理有重要的意义。本研究以福建柏为材料，利用双向电泳技术及质谱技术对福建柏盐胁迫差异蛋白质组学研究。　　本研究主要内容包括：⑴建立福建柏双向电泳技术体系。采取了TCA/丙酮法、酚提取法、以及TCA/丙酮法-酚提取法三种蛋白提取方法，7 cm长pH3-10， pH5-8，pH4-7三种IPG胶条、等电聚焦参数设定为20000 VH，25000 VH，30000 VH、丙烯酰胺凝胶分离胶浓度设定为10％与12.5%进行单因素分析，对福建柏双向电泳技术进行优化。采用三氯乙酸/丙酮-酚法提取福建柏叶片的蛋白点多且图像清晰，pH4-7 IPG胶条最适合福建柏叶片蛋白的分离，等电聚焦参数设定为25000 Vh，浓度为10%的分离胶进行福建柏双向电泳最好。⑵分析盐胁迫引起的差异蛋白质发现，福建柏在不同浓度盐胁迫条件下蛋白质丰度变化是不同的，通过软件分析蛋白质双向电泳图谱，得到表达变化明显的蛋白质，在胁迫条件下，有的是上调表达，有的是下调表达，不同蛋白的丰度变化是有显著差异的。用软件选取有效性T检验99%的蛋白，形状以及分离度较好并有两倍以上差异的蛋白点。结果有16个蛋白质在盐胁迫处理条件下呈现上调表达，5个蛋白质在盐胁迫处理下调表达。表明福建柏在盐胁迫条件下蛋白质差异是显著的。在进行2-DE实验中，每个蛋白样品都进行3次以上重复实验，以去除电泳过程中发生的误差。⑶在表达量上调差异中，蛋白质大多集中在酸性端，密集集中在酸性pH4-5之间，位于丙烯酰胺凝胶中部。而在蛋白质表达量下降的5个点中，分布比较分散。对双向电泳找出的21个差异蛋白进行质谱分析，检测成功20个蛋白，经过Mascot数据库检索后得到相应的蛋白编号。在蛋白网站输入对应的蛋白序列号查询相应的蛋白质的名称和功能，对检索结果分析归纳，结果发现差异蛋白功能主要体现了几个方面。碳固定、碳代谢相关蛋白5个，甘油二酸阴离子代谢相关蛋白3个，有机物光合作用碳固定相关蛋白3个，TCA循环相关蛋白2个，木质素生物合成相关蛋白2个，氧化磷酸化相关蛋白2个，半胱氨酸氮氨酸代谢相关蛋白2个，以及其他功能蛋白。表明在福建柏盐胁迫下参与的蛋白种类繁多，且分散在不同的代谢通路上。

目录

声明

1 前言

1.1植物响应盐胁迫的研究进展

1.1.1盐胁迫对植物的影响

1.1.2植物对盐分的适应机制

1.1.3提高植物抗盐能力的途径

1.2植物蛋白质组学研究进展

1.2.1蛋白质的提取

1.2.2蛋白质的分离

1.2.3蛋白质的鉴定

1.2.4生物信息学

1.2.5 前景

2材料与方法

2.1蛋白质双向电泳体系建立

2.1.1材料

2.1.2蛋白提取方法

2.1.3蛋白质裂解

2.1.4等电聚焦

2.1.5胶条的平衡

2.1.6垂直电泳与染色

2.1.7图像扫描与处理

2.2盐胁迫福建柏

2.2.1盐胁迫处理

2.2.2蛋白质的提取

2.2.3双向凝胶电泳

2.2.4平衡

2.2.5银染染色

2.2.6凝胶软件分析

2.3质谱分析

2.3.1质谱材料准备

2.3.2质谱分析

2.3.3数据库查询

2.4生物信息学分析

3结果分析

3.1蛋白质双向电泳结果

3.1.1不同提取方法对福建柏叶片蛋白质双向电泳的影响。

3.1.2不同胶条实验

3.1.3不同等电聚焦时间对福建柏叶片双向电泳的影响。

3.1.4不同浓度分离胶对福建柏双向电泳的影响

3.2盐胁迫引起蛋白差异结果分析

3.2.1盐胁迫双向电泳结果分析

3.2.2盐胁迫福建柏表达量上调蛋白质

3.2.3蛋白下调情况

3.3质谱结果分析

3.4生物信息学分析

4结论与讨论

4.1结论

4.1.1蛋白双向电泳体系的建立

4.1.2盐胁迫引起的差异蛋白质

4.1.3质谱鉴定结果

4.1.4生物信息学分析

4.2讨论

4.2.1不同IPG胶条与分离胶浓度对双向电泳的影响

4.2.2蛋白提取方法对福建柏的影响

4.2.3等电聚焦的影响

4.2.4盐胁迫条件下的双向电泳分析

4.2.5差异蛋白凝胶分布

4.2.6质谱鉴定与生信结果讨论

参考文献

附录1 Bradford法蛋白质定量

附录2 Bio-rad技术手册SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

攻读学位期间发表的论文

致谢