对褐飞虱有效的新型Bt Cry毒素的改造

摘要

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt），是目前应用最为广泛的微生物杀虫剂，在 Bt所产生的多种杀虫毒素中，Cry毒素是当前研究最为深入且应用最为广泛的一种，cry基因也已经被广泛应用与转基因作物中，成为农业生产中防治鳞翅目、鞘翅目、双翅目、线虫等Bt Cry毒素靶标昆虫的一种有效的途径，从而减少了对环境有负作用的化学农药的使用。　　然而，Cry毒素蛋白的杀虫谱仅局限于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等特定靶标昆虫，对于半翅目刺吸式口器的蚜虫、飞虱、叶蝉等昆虫暂时还没有有效 Cry毒素的报道。随着能够表达Cry毒素的转基因作物的大量种植及Bt制剂在农田中的广泛使用，鳞翅目、鞘翅目、双翅目等Cry靶标昆虫能够得到有效控制，而飞虱、叶蝉、蚜虫等半翅目非Bt靶标昆虫则依旧需要使用化学农药进行防治，甚至有大爆发的可能。因此，急需寻找或开发一种能够对此类半翅目害虫具有毒性作用的新型Cry毒素。　　本研究首先克隆、表达并制备了可溶的Cry1Ab毒素蛋白，利用获得的Cry1Ab蛋白，制备了高效价的兔抗Cry1Ab的多克隆抗血清。而后，利用膜饲喂法测定了Cry1Ab蛋白对重要水稻害虫褐飞虱（Nilaparvata lugens）的毒性作用。并结合体外水解与Pull-down技术，利用免疫印迹法分析了Cry1Ab毒素对褐飞虱只有低毒作用的原因进行了分析，发现Cry1Ab毒素能够在褐飞虱中肠内被水解且能够与褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡（brash border membrane vesicle, BBMV）结合。因此，推断Cry1Ab毒素对褐飞虱鲜有毒性作用的原因是其无法与正确的受体蛋白结合所致。　　另一方面，本研究利用蚜虫中肠内膜结合短肽对Cry1Ab毒素domainⅡ中决定受体识别的3个loop进行逐一替换，并测定了替换loop后的三株Cry蛋白对鳞翅目小菜蛾幼虫的毒性作用。研究发现，在Cry1Ab domainⅡ中决定受体识别的3个loop分别被替换后，Cry1Ab毒素对小菜蛾的毒性作用受到不同程度的影响，其中loop2被替换后，Cry1Ab对小菜蛾的毒性作用下降最为明显，LC50达到32.25μg/mL。由此可以推断，对于Cry1A毒素而言，在受体识别功能作用上domainⅡ中的loop2起到的作用最大。　　为了获得对褐飞虱具有较好毒性作用的新型Cry毒素，本研究利用噬菌体短肽文库展示技术筛选出了能够与水稻褐飞虱中肠内膜结合的短肽 P2S。通过将P2S与加强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）基因的融合，制备了P2S-EGFP融合蛋白，利用Pull-down技术及荧光显微镜观察，验证了P2S与褐飞虱中肠内膜及BBMV较强的结合能力。随后，本研究利用分子区域替换技术，使用能够与褐飞虱中肠内膜结合的短肽 P2S及本实验室早先筛选出的能够与褐飞虱中肠BBMV结合的短肽P1Z分别对Cry1Ab决定受体识别的3个loop分别进行了替换获得了六株新型的cry基因，并对六株新型Cry蛋白进行了原核表达及纯化。通过体外水解、Pull-down体外结合及膜饲喂法生测，筛选出一株在褐飞虱中肠中最稳定，与褐飞虱中肠BBMV结合能力最强且对褐飞虱毒性作用最好的新型Cry毒素Cry1Ab-2S。该毒素将Cry1Ab对褐飞虱的毒性作用提高了近13倍。而后，本研究还利用透射电镜对取食了Cry1Ab-2S的褐飞虱中肠超微组织进行观察，发现其中肠内膜细胞有明显被消解的现象，证明了Cry1Ab-2S对褐飞虱的良好毒性作用。本研究为利用基因工程定向改造Cry毒素，为发展针对特定害虫作用的Cry毒素研究提供了可行的途径；为Cry毒素及其他昆虫毒素在昆虫体内受体的研究提供了新的思路；为应用分子工程手段发展新型害虫毒素提供理论和应用基础；为Cry和其它昆虫毒素的毒理机制研究提供新的手段。　　本研究的特色与创新点主要包括：　　1.分析了Cry毒素对半翅目褐飞虱等刺吸式口器害虫无法产生良好毒性作用的原因；　　2.证明了domainⅡ三个受体识别loop对Cry1Ab毒性影响的重要性；　　3.将噬菌体短肽文库展示技术与膜饲喂法相结合，成功筛选出能够穿透围食膜与褐飞虱中肠内膜结合的短肽；　　4.通过定向改造、筛选，获得了能够对非Bt靶标的半翅目刺吸式口器害虫褐飞虱产生较好毒性作用的新型Cry毒素。

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第一章 前言

1. 水稻褐飞虱

2. 苏云金杆菌及其Cry毒素

3. Cry毒素分子改造研究进展

4. Cry毒素对半翅目害虫毒性研究进展

5. 噬菌体短肽文库及其应用

6. 本研究的目的与意义

第二章 褐飞虱的饲养及膜饲喂法的建立

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

第三章 cry1Ab基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

第四章 Cry1Ab毒素与褐飞虱肠道关系的研究

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

第五章 Cry1Ab毒素决定受体识别三个环区重要性分析

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3．讨论

第六章 褐飞虱中肠内膜结合短肽的筛选

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

第七章 定向改造、筛选对褐飞虱高毒力的新型Cry毒素

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

参考文献

致谢