RGD肽修饰的相变型纳米粒联合低强度聚焦超声对胃癌的体内外寻靶及显像研究

摘要

目的:　　胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，是全球第二大癌症死亡原因，为了提高胃癌患者的生存率，需加强对早期胃癌的诊断，以期获得更多的治疗机会。对于无明显临床症状的早期胃癌的筛查，超声造影成像作为一种无创无辐射的影像学诊断方式，是其重要辅助诊断方式。近年来超声造影成像结合分子成像技术，极大的提高了对肿瘤部位超声显像的特异性和敏感性。超声分子成像的核心是受体及配体特异性结合提供的靶向性，研究表示胃癌细胞表面高表达整合素家族αvβ3，其特异性配体RGD肽（Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）有潜力为胃癌靶向成像提供分子基础。另外，液态氟碳材料因其独特的声致相变优势，在超声分子成像中可通过液气相变作用同时提高造影剂的EPR效应及回声强度。因此，本实验拟制备RGD肽修饰的载全氟己烷（perfluorohexanes, PFH）高分子聚合物纳米粒（RGD-PFH-NPs）作为超声造影剂，考察其基本特性、体内外靶向性，并联合低强度聚焦超声（low-intensity focused ultrasound, LIFU）进行体内外超声成像。　　方法:　　1.通过双乳化法制备包裹PFH的非靶向纳米粒PFH-NPs，然后通过碳二亚胺法将RGD肽连接于PFH-NPs表面制备得靶向纳米粒RGD-PFH-NPs。　　2.（1）通过光学显微镜观察RGD-PFH-NPs基本形态和分散情况；通过Malvern激光粒径仪测量RGD-PFH-NPs平均粒径、电位，以及连续7天测量其粒径变化情况以考察其储存稳定性；通过流式细胞仪量化RGD肽与PFH-NPs连接率；通过加热板提供热致相变条件，考察RGD-PFH-NPs体外相变能力。（2）通过CCK-8法评估RGD-PFH-NPs的细胞毒性及不同LIFU能量对细胞的损伤作用。　　3.（1）通过激光共聚焦显微镜观察RGD-PFH-NPs对人胃癌细胞株MGC803的靶向结合作用。（2）通过Esaote Mylab 90 超声诊断仪观察琼脂糖凝胶模型中RGD-PFH-NPs体外超声成像能力，考察其联合LIFU前后回声强度的变化，通过DFY软件量化各声强值。　　4.（1）通过对裸鼠背部皮下注射MGC803细胞构建荷瘤裸鼠模型，通过尾静脉注射RGD-PFH-NPs，分别在24 h后及7 d 后取出其主要器官进行切片H＆E染色观察RGD-PFH-NPs在体内对各组织损伤作用。（2）通过Esaote Mylab 90 超声诊断仪观察荷瘤裸鼠注射不同纳米粒前后及联合LIFU前后肿瘤部位的超声成像情况变化，考察造影剂的体内显像能力，并对比其与声诺维成像的持续时间，通过DFY软件量化各声强值。（3）通过激光共聚焦显微镜观察靶向组和非靶向组荷瘤裸鼠肿瘤组织中及主要器官中纳米粒的聚集情况，考察其体内肿瘤靶向性及组织分布。　　结果:　　1.（1）制备的PFH-NPs、RGD-PFH-NPs样品均为乳白色混悬液，光镜显微镜下呈点状，分散均匀，透射电镜下观察为球形，大小均匀，呈核壳状结构；平均粒径（259.3±42.6）nm，Zeta电位（-17.6±5.4）mV，稳定性良好，7天内粒径大小无明显变化；激光共聚焦显微镜下观察到RGD肽与PFH-NPs荧光大部分重合，流式细胞仪测得其连接率为89.13%；加热至70℃时RGD-PFH-NPs发生明显相变，80℃时测得粒径增大至（1042.4±227.5）nm；（2）CCK-8法测得不同浓度RGD-PFH-NPs对细胞存活率无明显影响，不同LIFU强度辐照细胞后其存活率无明显下降，说明RGD-PFH-NPs及LIFU对细胞无明显毒副作用。　　2.（1）体外二维超声模式和造影增强模式下观察，随着LIFU时间的延长，造影效果越来越强，到5 min时达到造影回声强度峰值，光学显微镜观察到纳米粒随着LIFU时间延长相变逐渐增强的过程。（2）激光共聚焦显微镜观察到靶向RGD-PFH-NPs组MGC803细胞周围随着时间延长纳米粒聚集不断增多，而非靶向PFH-NPs组MGC803细胞周围3 h内仅少量纳米粒聚集，两组纳米粒和MGC803细胞结合率分别为82.59%、2.96%。　　3.（1）荷瘤裸鼠注射RGD-PFH-NPs后在肿瘤部位联合LIFU辐照，可观察到肿瘤部位超声成像显著增强，而未联合LIFU辐照则不能观察到回声增强，另外注射PFH-NPs后在肿瘤部位联合LIFU辐照，观察到超声成像无明显增强，说明RGD-PFH-NPs不但能靶向聚集在肿瘤部位并可在LIFU刺激下增强超声造影显像功能。（2）RGD-PFH-NPs在肿瘤部位增强超声成像效果与声诺维相比，回声峰值胶声诺维低，但可持续增强60 min以上，较声诺维持续时间大幅度延长。（3）激光共聚焦显微镜观察到RGD-PFH-NPs、PFH-NPs均主要聚集于肝脏和脾脏， RGD-PFH-NPs在肿瘤实质组织中大量累积，而PFH-NPs仅少量纳米粒聚集，说明肿瘤肿瘤组织中靶向RGD-PFH-NPs组的纳米粒累积显著高于非靶向PFH-NPs组（P＜0.05）。　　结论:　　本实验成功制备出的胃癌靶向相变型纳米粒RGD-PFH-NPs，并具有良好超声造影成像功能，对人胃癌细胞MGC803及胃癌组织有明显的靶向作用，有望成为一种新型的胃癌超声靶向造影剂。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 PFH-NPs、RGD-PFH-NPs的制备及体外基本性质检测

1 材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2 结果

2.1 RGD-PFH-NPs的基本性质

2.2 RGD与PLGA的连接结果

2.3 RGD-PFH-NPs体外超声成像

2.4 RGD-PFH-NPs的细胞毒性

2.4 RGD-PFH-NPs细胞寻靶

3 讨论

参考文献

第二部分 RGD-PFH-NPs体内超声成像和靶向性

1 材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2 结果

2.1 RGD-PFH-NPs体内生物安全性

2.2 RGD-PFH-NPs体内超声成像

2.3 RGD-PFH-NPs体内靶向性

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述:胃癌靶向成像的研究进展

致谢

攻读学位期间发表学术论文、参研项目、学术交流等