维生素A及其核受体与睑板腺上皮角化的相关性及其机制研究

摘要

目的 霰粒肿是我国低龄儿童最常见的眼表疾病之一。睑板腺导管开口阻塞与睑板腺上皮过度角化关系密切，是导致霰粒肿的主要原因，但具体机制尚不清楚。研究发现上皮细胞的过度角化与维生素 A （Vitamin A, VA)缺乏相关。我们前期研究发现霰粒肿儿童血清维生素A水平明显低于正常儿童，故推测VA缺乏可能通过睑板腺中其核受体通路，对下游某些维持上皮正常角化基因的表达产生影响。这一过程可能是睑板腺上皮发生过度角化的一个新机制。　　方法 采用SD大鼠建立边缘性维生素A缺乏(MarginalVitamin A Deficiency，MVAD)动物模型，分离其睑板腺组织进行研究。采用 HE染色观察睑板腺组织形态结构，PCR检测MVAD与正常SD大鼠VA核受体各亚型的基因表达水平，免疫荧光及Western blot检测VA核受体各亚型在睑板腺的表达及分布。明确睑板腺中VA核受体的主要亚型分布及其信号通路。建立MVAD动物模型，随机分组为：MVAD组及VA补充（VitaminASupplement, VAS）组。采用免疫荧光法检测VAN组、MVAD组及VAS组大鼠睑板腺中VA核受体上游调节蛋白CRABP2和FABP5的表达及定位。采用Illumina技术对各VAN、MVAD及VAS组睑板腺组织进行高通量基因测序，分析差异表达基因，通过 DAVID 数据库获得差异表达基因的基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析，明确与上皮角化相关的目的差异基因。最后采用qPCR验证差异基因表达情况。　　结果 采用经典维生素 A 缺乏饲料喂养SD大鼠能成功并稳定地构建 MVAD 动物模型。HE 染色显示 MVAD 组睑板腺导管上皮厚度变薄（P＜0.05），分泌细胞细胞核减小（P＜0.01）。MVAD 组大鼠睑板腺睑板腺上皮角化过度明显，导管中角质透明蛋白颗粒增多。VAN及MVAD 大鼠睑板腺中均能检测到RAR-α、-β、-γ，RXR-α、-β、-γ mRNA的表达，RXR-α mRNA表达量最高，MVAD可致其表达明显下调。免疫荧光显示 VA 核受体均呈核表达：VAN 组睑板腺腺泡细胞细胞核内RAR-α、RAR-γ、RXR-α、-β、-γ 均有表达；导管上皮细胞仅有有RXR-γ 表达。MVAD组中只有RAR-α、RXR-α 和RXR-γ 表达阳性，导管上皮细胞无RARs及RXRs蛋白表达。WB结果显示：RAR-α、RAR-γ ， RXR-α、RXR-β、RXR-γ 受体蛋白在VAN及MVAD大鼠睑板腺中均有表达，但RAR-β 蛋白几乎没有表达，MVAD大鼠睑板腺中RXR-α 和RXR-γ蛋白表达较VAN大鼠明显明显下降（P＜0.01）。在睑板腺腺泡细胞中， FABP5 主要在细胞质中表达，CRABP2 在细胞质及细胞核内均有表达。MVAD 引起的 CRABP2/FABP5 相对表达量增高；MVAD 给予 VA 补充后CRABP2/FABP5相对表达量降低。Illumina高通量基因测序异基因分析显示：MVAD组与VAN组差比较：差异基因中上调基因1531个，下调基因1508个。MVAD与VAS组比较：差异基因中上调基因453个，下调基因355个。差异基因GO富集分析与角化相关的差异基因Krt1、Krt7、Krt8、Krt10、Krt16、Krt17差异显著性最高。经qPCR验证后，MVAD引起 Krt1、Krt7、Krt8、Krt10、Krt16、Krt17 的表达下调，Krt17表达增强。MVAD大鼠给予VA补充至外周血清VA水平正常时，Krt1、Krt7、Krt8、Krt10、Krt16 基因表达水平仍未恢复，Krt17 基因表达水平恢复正常。　　结论 经典维生素A缺乏饲料建立SD大鼠的MVAD模型稳定性、重复性高。SD大鼠睑板腺组织结构与人睑板腺组织结果具有高度相似性，适于用于人类睑板腺相关疾病的基础研究。MVAD 导致睑板腺腺泡细胞过度成熟，角化过度，角质颗粒增加可能通过与角化相关基因调控有关。VA通过CRABP2/FABP5相对表达量调控，经RXR-α 核受体信号通路，调节Krt基因表达水平，是VA调控睑板腺上皮正常角化过程的主要机制。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 维生素A缺乏动物模型建立

前言

1 材料和方法

1.1 材料和动物

1.2 方法

2.结果

2.1 动物模型及血清学评价结果

2.2 动物模型睑板腺组织结构

3.讨论

参考文献

第二部分 维生素A缺乏对大鼠睑板腺组织学及VA核受体表达的影响

前言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 HE染色观察MVAD对睑板腺形态学的影响

2.2 qPCR检测大鼠睑板腺中RAR（α、β、γ）、RXR（α、β、γ）各亚型受体mRNA表达及差异

2.3 MVAD的SD大鼠睑板腺中RAR（α、β、γ）、RXR（α、β、γ）蛋白定位及表达的影响

3 讨论

参考文献

第三部分 维生素A 对睑板腺上皮角化相关基因的调控机制

前言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2方法

2.结果

2.1 MVAD与VAS血清VA检测

2.2 MVAD及VA补充后核受体上游结合蛋白（CRABP2、FABP5）表达的影响

2.3 MVAD及VA补充后对睑板腺上皮基因表达谱的影响

3.讨论

3.1 MVAD及VAS对RA核受体上游调节蛋白的影响

3.2 MVAD及VAS对睑板腺角化及其基因调控机制

参考文献

全文总结

文献综述:核受体在睑板腺中的研究进展

致谢

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