长链非编码RNA CCAT2通过增强NDRG1启动子活性促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力

摘要

背景:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是肝癌最常见的病理类型，占85-90 %。同时，肝细胞肝癌的发生率和死亡率均居世界前列。肝细胞肝癌由于起病隐匿、进展迅速、恶性程度高等特点, 急需揭示其发病机制，提高对HCC的诊断和治疗。研究发现，许多长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）的异常表达与肝癌的发生发展过程密切相关。而lncRNA CCAT2已经被报道在多种肿瘤中扮演重要角色，但其在HCC中的作用仍未明确。　　目的:　　1.明确lncRNA CCAT2在肝细胞肝癌中的生物学功能。　　2.阐释CCAT2影响肝癌细胞功能的具体作用机制。　　3.阐释CCAT2与靶基因间具体作用关系。　　方法：　　第一部分: CCAT2在HCC细胞和组织中的表达研究　　1.RT-qPCR检测lncRNA CCAT2在四种肝癌细胞系（SMMC7721、Huh7、HepG2、SK-Hep1）以及正常永生化肝细胞系（L02）中的表达情况。　　2.进一步检测CCAT2在20对HCC病人肿瘤组织及对应癌旁组织中的RNA水平。　　第二部分：CCAT2在HCC中的生物学功能研究　　1.构建 CCAT2 的过表达质粒，设计并筛选针对 CCAT2 的干扰shRNA。通过 MTS 实验、克隆形成实验、transwell 小室实验（铺胶/不铺胶）、划痕实验、流式细胞术等体外实验检测 CCAT2对肝癌细胞系SMMC7721和SK-Hep1生物学功能的影响。　　2.构建CCAT2过表达及干扰稳定细胞系，通过裸鼠皮下成瘤实验和肝脏原位转移实验验证 CCAT2 在体内对肝癌细胞成瘤和转移的影响。　　第三部分：CCAT2作用靶基因筛选及靶基因生物学功能研究　　1. RT-qPCR筛选CCAT2作用的靶基因，并通过RT-qPCR和WB检测过表达/干扰CCAT2后靶基因表达水平的变化情况。　　2. RT-qPCR、WB、免疫组织化学实验（Immunohistochemistry，IHC）等技术检测靶基因 NDRG1 在肝癌细胞系及肝癌组织中的表达，分析HCC病例中CCAT2与NDRG1表达的相关性。　　3.构建NDRG1全长过表达质粒，进行一系列生物学功能实验验证NDRG1 在肝癌细胞 SMMC7721 和 SK-Hep1 中的作用，并通过与CCAT2共转染后的NDRG1表达量检测及生物学功能检测探究CCAT2如何通过NDRG1在肝癌细胞中发挥作用。　　4.验证体内实验中，CCAT2对NDRG1表达的调控作用。　　第四部分：CCAT2调控靶基因NDRG1的分子机制研究　　1.通过NCBI数据库找到NDRG1启动子序列，构建其启动子全长的双荧光素酶报告基因质粒。通过双荧光素酶报告基因实验检测CCAT2对NDRG1启动子活性影响。　　2.构建NDRG1启动子截短区间的双荧光素酶报告基因质粒。通过双荧光素酶报告基因实验检测CCAT2对NDRG1启动子各个区段活性影响，确定CCAT2的活性作用区间。　　结果：　　第一部分: CCAT2在HCC细胞和组织中的表达研究　　1. CCAT2在四种肝癌细胞系中表达均高于正常L02细胞系。　　2. 20对HCC组织标本中，CCAT2在肝癌组织中的表达较对应癌旁组织呈升高趋势。　　第二部分：CCAT2在HCC中的生物学功能研究　　1. CCAT2能促进肝癌细胞系SMMC7721、SK-Hep1的增殖、迁移侵袭能力。　　2.在裸鼠皮下成瘤和肝脏原位转移模型中，注入过表达CCAT2稳定细胞系能促进肝癌细胞的成瘤、肝脏原位转移和远处肺转移能力，干扰则相反。　　第三部分：CCAT2作用靶基因筛选及靶基因生物学功能研究　　1.过表达CCAT2能够上调NDRG1的表达,干扰则相反。NDRG1是CCAT2作用的下游靶基因。　　2. NDRG1在肝癌细胞系及20对HCC组织标本中表达均升高，且在临床病例中分析得到，CCAT2与NDRG1表达呈正相关。　　3.过表达NDRG1能促进肝癌细胞系SMMC7721、SK-Hep1的增殖、迁移侵袭能力。CCAT2能特异性调控NDRG1的表达及生物学功能。　　4.在小鼠体内实验中，过表达CCAT2组小鼠肿瘤组织NDRG1表达增加，干扰则相反。　　第四部分：CCAT2调控靶基因NDRG1的分子机制研究　　1. CCAT2增强NDRG1启动子的转录活性。　　2.CCAT2对NDRG1启动子的作用区间主要位于-1000～-500 bp区段。　　结论：　　长链非编码RNA CCAT2通过增强NDRG1启动子转录活性，使NDRG1表达增加，从而促进肝癌细胞的增殖、迁移侵袭能力。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分: CCAT2在HCC细胞和组织中的表达研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

1.3统计学分析

2结果

2.1 CCAT2在HCC细胞系中表达上调

2.2 CCAT2在20对HCC病人肿瘤组织标本中表达呈上升趋势

3讨论

参考文献

第二部分 CCAT2在HCC中的生物学功能研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

1.3统计学分析

2结果

2.1 CCAT2全长过表达质粒及干扰shRNA构建

2.2生物学功能实验检测CCAT2对肝癌细胞功能影响

2.3裸鼠体内实验验证CCAT2促进肝癌细胞增殖、转移能力

3讨论

参考文献

第三部分 CCAT2作用靶基因筛选及靶基因生物学功能研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

1.3统计学分析

2结果

2.1筛选CCAT2作用的下游靶基因

2.2 NDRG1在肝癌细胞系和HCC组织中的表达情况

2.3敲低CCAT2能部分逆转NDRG1的表达和生物学功能

2.4体内实验中，CCAT2对NDGR1表达的影响

3讨论

参考文献

第四部分 CCAT2调控NDRG1机制研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

1.3统计学分析

2结果

2.1 NDRG1启动子区质粒构建

2.2 CCAT2增强启动子pGL3-NDRG1(promoter) 荧光素酶活性

2.3 NDRG1启动子区域截短，确定CCAT2对NDRG1启动子作用的活性区间

3讨论

参考文献

全文总结

参考文献

文献综述:肝细胞肝癌EMT相关lncRNA的研究进展

参考文献

致谢

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