低强度纳秒脉冲电场联合MWCNTs杀伤A375细胞的剂量效应

摘要

纳秒脉冲电场（nsPEF）可以通过诱导细胞凋亡而使肿瘤组织缩小甚至消失，对于肿瘤治疗具有特别重要的意义。但是由于脉宽过窄，为了保证疗效必须提高脉冲幅值，高场强容易导致组织的沿面放电和肌肉收缩，严重影响了治疗过程中的电气安全性。具有优异电学特性的准一维纳米材料多壁碳纳米管（MWCNTs）已经被证明可以提高脉冲电场的生物电效应，nsPEF与MWCNTs在肿瘤治疗中的联合应用有望显著降低外加电场，从而提高治疗过程中的电气安全性。为了对后续开展机理研究时选择脉冲参数提供必要的参考依据，本文通过实验和仿真开展了低强度nsPEF联合MWCNTs对癌细胞杀伤效果的剂量效应研究。　　首先，通过CCK-8检测方法在确定MWCNTs安全浓度的基础上研究了nsPEF联合MWCNTs影响离体A375细胞活性的剂量效应，基于logistic模型利用一元非线性回归分析方法建立了细胞活性与场强E、脉宽τ、脉冲个数N等单因素以及多因素间的定量函数关系。结果表明细胞活性随单一脉冲参数的变化整体呈现剂量越大，活性越低的规律。细胞活性随场强、脉宽的变化具有阈值效应（S型变化），但是随脉冲个数却没有明显的阈值效应（指数型变化），并且随单一脉冲参数的变化都呈现饱和效应。细胞活性随脉冲能量密度σE2τN的增加呈现S型下降。　　其次，在细胞活性实验的基础上通过Annexin V/PI染色法研究了低强度nsPEF联合 MWCNTs 对癌细胞凋亡坏死率的影响，分析造成细胞活性下降的内在机制。结果表明，细胞凋亡率和坏死率随场强、脉宽、脉冲个数的增加而增加，从而导致细胞活性的降低。　　最后，通过 COMSOL 软件建立球形单细胞五层介电模型，仿真分析了加入MWCNTs后不同纳秒脉冲参数对细胞内外膜穿孔特性的影响。结果表明，当场强或者脉宽低于一定阈值时，nsPEF对细胞内外膜的穿孔特性几乎无影响，而超过这一阈值后，场强或脉宽的增加都会增强内外膜的电穿孔效应。脉冲个数越多，细胞内外膜的穿孔状态维持时间越久，膜穿孔通量越大，导致内外物质的交换越充分，细胞死亡率越高。仿真结果与细胞实验结果体现出来的变化规律基本一致。　　细胞实验及仿真结果表明，MWCNTs的引入不影响上述变化规律，但是可以显著增强 nsPEF 对肿瘤细胞的杀伤效果和电穿孔效应，并且增强机制是基于其尖端集电效应，可以畸变增强局部电场。加入MWCNTs后可以在发挥nsPEF诱导肿瘤细胞凋亡的优势前提下提高其杀伤效果以及电气安全性，具有重要的意义。

目录

1 绪 论

1.1 研究目的及意义

1.2 纳秒脉冲电场在肿瘤治疗中的电气安全性研究现状

1.3 CNTs提高脉冲电场生物电学效应的研究现状

1.4 本文主要研究内容

2 纳秒脉冲电场联合MWCNTs对肿瘤细胞活性的影响

2.1 引言

2.2 实验平台的搭建

2.3 实验材料及方法

2.3.1 细胞培养

2.3.2 CCK-8检测细胞活性

2.3.3 MWCNTs毒性的确定

2.3.4 纳秒脉冲电场处理细胞

2.3.5 数据的统计学分析

2.4 MWCNTs浓度对细胞活性的影响

2.5 纳秒脉冲参数对细胞活性的影响

2.5.1 细胞活性随单脉冲因素的定性变化规律

2.5.2 细胞活性随单脉冲因素的定量关系

2.5.3 细胞活性与多脉冲因素间的归一化关系

2.6 本章小结

3 纳秒脉冲电场联合MWCNTs对肿瘤细胞凋亡坏死率的影响

3.1 引言

3.2 实验材料及方法

3.2.1 纳秒脉冲电场处理细胞

3.2.2 Annexin V/PI法检测细胞凋亡坏死率

3.3 纳秒脉冲参数对细胞凋亡坏死率的影响

3.3.1 细胞凋亡坏死率随单脉冲因素的定性变化规律

3.3.2 细胞凋亡坏死率随单脉冲因素的定量关系

3.3.3 细胞凋亡坏死率与多脉冲因素间的归一化关系

3.4 细胞凋亡坏死率与活性实验结果的对比分析

3.4.1 CCK-8与Annexin V/PI法检测细胞杀伤率的原理对比

3.4.2 CCK-8与Annexin V/PI法检测细胞杀伤率的结果对比

3.5 本章小结

4 纳秒脉冲电场联合MWCNTs影响细胞杀伤效果的穿孔机理影响

4.1 引言

4.2 肿瘤细胞电穿孔模型的建立

4.2.1 几何模型

4.2.2 电穿孔数学模型

4.2.3 模型参数属性

4.3.1 MWCNTs对空间电场分布的影响

4.3.2 MWCNTs对纳秒脉冲电场作用下细胞内外膜穿孔特性的影响

4.4.1 场强的影响

4.4.2 脉宽的影响

4.4.3 脉冲个数的影响

4.5 本章小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读硕士学位期间取得的科研成果目录

C. 学位论文数据集

致谢