错配识别蛋白MutS的重组表达和活性研究

摘要

错配修复系统广泛的存在于生物体中，由于这个系统的存在保证了DNA复制过程中的保真度。在原核大肠杆菌和嗜热栖生菌中同样也有这一系统的存在，且大肠杆菌是第一个被发现的。错配识别蛋白MutS是错配修复系统中一系列蛋白的其中之一，且在行使功能时第一个发挥作用。错配识别蛋白MutS可以单独的识别并结合未配对的和含有错配的DNA双链，并能结合由于碱基的缺失或多余而引起的突出环。
　　 出现于20世纪60年代的合成生物学在21世纪得以正式的发展，在其发展过程中取得了重大的成就和一系列的突破。随着DNA自动化合成效率的继续提高和基因组数据库的逐渐丰富，为DNA的合成提高了条件，但是基因组移植技术和大片段扩增技术是合成生物学的两大技术瓶颈。DNA错配修复是大片段扩增技术的一大难点之一，其解决方法之一就是蛋白介导的错配修复。这个蛋白质就是错配识别蛋白MutS。这一方法为DNA合成中经常出现的错配问题提供了更好的解决方案，使合成生物学能够得到更好的发展。
　　 本实验中我们构建了E.coli和T.thermophilus的错配识别蛋白MutS的原核表达载体pET-32(a+)-EmutS和pET-32(a+)-TmutS；并在大肠杆菌BL21(DE3)得以表达，通过疏水作用亲和层析和离子交换层析纯化得到了具有一定纯度的MutS蛋白。
　　 利用凝胶滞缓实验分别检测了E.coli和T.thermophilus的MutS蛋白的错配识别活性，与含有错配位点的DNA作用有滞后带出现。当DNA：E-MutS蛋白的分子个数比为1:4时，测序比对后，统计出E.coli的MutS蛋白使含有1-3个错配位点的DNA错配率分别由53％、60％、58％下降到36％、35％和33％；DNA的错配率分别降低了17％、25％和25％。T.thermophilus的MutS蛋白作用于含有一个错配位点的DNA双链，当DNA：MutS蛋白的分子个数比分别为1:4、1:6、1:8时，DNA的错配率分别由58％、59％、57％降低到3596、32％、31％；双链DNA的错配率分别降低了23％、27％、26％。
　　 由此，我们成功的构建、表达并纯化了大肠杆菌MutS和嗜热栖生菌的MutS蛋白，并通过凝胶滞缓实验对这两种蛋白的进行了活性研究。得出的结论是E-MutS和T-MutS蛋白均能明显降低DNA的错配率，并寻找了T-MutS蛋白作用1/1000错配率的DNA的最佳分子数比是：1:6-1:8，且相同分子个数比的T-MutS蛋白的活性较E-MutS强。