聚焦超声联合载MTX超声微泡定位释放技术对滋养细胞作用的实验研究

摘要

聚焦超声是使用体外聚焦超声能量来源的一种非侵入性的技术，这项技术首先由Lynn提出，其发展至今已经历了50多年的历程。聚焦超声主要是通过与皮肤耦合，准确定位目标组织，使焦点区域的组织温度迅速升高，几秒内可达60℃甚至更高，因此使靶区组织由于大量热能沉积而发生蛋白质凝固、破坏，导致凝固性坏死。目前，聚焦超声技术已广泛应用于临床，然而，近年来研究发现聚焦超声的应用存在一定的局限性。首先，当靶组织位置深，体积大、血供丰富时，伴随距离的增加、血流的影响，能量会产生衰减。另外，聚焦超声治疗时两个损伤区域会相互干扰。而超声微泡造影剂能够有效改变靶向区域的声环境，提高聚焦超声的疗效。载药超声靶向微泡是近年来国内外研究的热点，目前已制备出纳米级微泡。近年来聚焦超声联合载药超声微泡对实体肿瘤治疗的研究与临床应用已广泛开展。　　胎盘的发育过程中滋养细胞扮演了重要的角色。胚胎的滋养层细胞与肿瘤细胞的生物学特性惊人地相似，其通过侵入子宫而将胚胎粘附于子宫内膜上，再侵入血管内皮使母体血管重建，从而开启胎盘的血流供应，但与肿瘤浸润不同的是滋养细胞的侵袭受到严格的时空调控。通过这一调控，人类正常的滋养细胞侵袭仅限于子宫内膜及浅肌层的1/3。而胎盘滋养细胞的异常侵袭则导致了临床上多种疾病的发生，如胎盘植入、侵袭性葡萄胎、绒癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤等。　　本实验中，我们成功制备了载MTX超声微泡，并对其特性进行了检测;通过体内和体外实验，研究聚焦超声与载MTX超声微泡对滋养细胞和孕鼠胎盘的影响以及相关作用机制，以此来探讨将聚焦超声与载MTX超声微泡联合应用到滋养细胞相关疾病中的理论基础及可行性。本研究为构建一种新型的药物剂型提供了新策略，也为临床上滋养细胞相关疾病的治疗提供了新方向。本课题主要包括以下三个部分:　　第一部分载MTX超声微泡制备及一般特性研究　　目的：制备一种载MTX超声微泡并检测其物理特性，评估作为一种新型超声造影剂携带药物的方式。　　方法：采用双乳化法法制备载MTX超声微泡，测定其浓度、粒径分布范围、包封率、电位以及载药量等特性;观察60COγ射线灭菌前及灭菌后微泡特性的差异，观察不同储存条件下微泡特性的改变;同时检测超声照射后载药微泡内药物的释放。　　结果：载MTX微泡的浓度为1.7×109～2.3×109/ml;粒径分布范围为368.7～619.6nm，平均粒径为521.4nm，单纯微泡浓度为3.4×109～4.1×109/ml;微泡的包封率高于40％，载药量高于4.0％;Zeta电位-(8.2±6.65)mV;60COγ射线灭菌前及灭菌后微泡特性无显著差异，微泡在4℃、-20℃储存7天后特性有所改变;使用超声辐照微泡溶液后，药物可释放。　　结论：本实验成功制备了载MTX超声微泡，其粒径均匀、包封率较高、性质稳定，超声辐照后可以使微泡破裂，促使超声微泡中的药物释放。　　第二部分载MTX超声微泡联合超声靶向微泡破裂对人滋养细胞作用的实验研究　　目的：研究人HTR-8滋养细胞株的体外培养条件及甲氨蝶呤体外治疗的适宜浓度，以此探讨载MTX超声微泡联合超声靶向微泡破裂对人HTR-8滋养细胞的形态学、增殖抑制、诱导细胞凋亡作用及其相关蛋白和基因表达水平的影响。　　方法：体外培养人HTR-8滋养细胞，观察其生长状态，CCK-8试剂盒检测生长特性，绘制生长曲线。CCK-8法检测不同浓度MTX对人HTR-8滋养细胞的增殖抑制率，并确定适宜的MTX体外作用浓度。实验分为6组:对照组(C)、单纯微泡+超声组(PM+US)、载MTX微泡组(MMTX)、单纯药物组(MTX)、药物+超声组(MTX+US)、载药微泡+超声组(MMTX+US)。CCK-8法检测不同时间点各组人HTR-8滋养细胞的增殖抑制率;Transwell侵袭实验检测各组人HTR-8滋养细胞体外侵袭能力;AnnexinⅤ-FITC荧光染色检测6组细胞的凋亡情况;WesternBlotting法和实时定量PCR检测Bcl-2、Bax、TIMP-1和MMP-9在蛋白和基因水平的表达情况。　　结果：在人HTR-8滋养细胞的培养过程中，确定最佳接种浓度为1×105个/ml。应用一定浓度MTX可以抑制人HTR-8滋养细胞的生长，且呈明显浓度-时间-效应关系。MMTX+US组在各时间点对HTR-8细胞的增殖抑制作用均明显强于其它各组，其增殖抑制率与其它各组相比差异均有显著性(P＜0.01)。Transwell实验检测各组滋养细胞的迁移率，结果显示MMTX+US组的细胞迁移率明显低于其他各组（P＜0.01），流式细胞仪检测结果显示，MMTX+US组细胞凋亡率明显高于其它各组(P＜0.01)。MMTX+US组Bax和TIMP-1的蛋白和基因表达水平明显高于其它组，而Bcl-2和MMP-9的蛋白和基因表达水平明显低于其它各组，且差异有统计学意义(P＜0.01)。　　结论：MTX对人HTR-8滋养细胞有增殖抑制作用，确定MTX的后续实验浓度为1×10-9mol/L。载MTX超声微泡联合超声靶向微泡破裂对人HTR-8滋养细胞有明显的增殖抑制作用，可以诱导细胞发生凋亡，其作用机制可能是通过调控细胞凋亡与侵袭相关的多个蛋白和基因的表达水平。　　第三部分聚焦超声联合载MTX超声微泡对孕鼠胎盘作用的实验研究　　目的：探讨聚焦超声联合载MTX超声微泡对孕鼠胎盘的作用及相关机制。　　方法：90只妊娠SD大鼠随机分为6组:对照组(C)、单纯微泡+超声组(PM+US)、载MTX微泡组(MMTX)、单纯药物组(MTX)、药物+超声组(MTX+US)、载药微泡+超声组(MMTX+US)。孕19d进行干预，对照组孕鼠尾静脉注射生理盐水2ml;载MTX微泡组尾静脉注射含MTX1mg的载药微泡2ml;单纯药物组尾静脉注射2ml MTX(含MTX1mg)，三组均开腹暴露10min后关腹。其余三组孕鼠尾静脉注射相应物质后30s均采用重庆海扶技术有限公司研制的海极星超声波治疗仪进行辐照，10min后关腹。24h后开腹取出胎盘组织，免疫组织化学法检测各组胎盘组织中Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9的表达，TUNEL法检测各组胎盘的细胞凋亡，Western Blotting法检测各组孕鼠胎盘组织中Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9蛋白的表达，实时荧光定量PCR检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9 mRNA的相对表达水平。　　结果：(1)各组胎盘组织中均有Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9的表达。Bcl-2、MMP-9MMTX+US组表达最弱，Caspase-3、Bax和TIMP-1在MMTX+US组表达最强，且差异均有意义(P＜0.01)。(2)各组细胞凋亡指数比较，MMTX+US组最高，且与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。(3) Bcl-2、MMP-9蛋白表达水平对照组最高，而MMTX+US组最低，与其他各组差异明显(P＜0.01); Caspase-3、Bax、TIMP-1蛋白表达水平MMTX+US组表达最高，且与其他组比较差异显著(P＜0.01)。(4) Bcl-2、MMP-9 mRNA表达水平MMTX+US组最低，且与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.01);MMTX+US组Caspase-3、Bax、TIMP-1 mRNA表达水平则最高，且与其他组比较差异显著(P＜0.01)。　　结论：聚焦超声联合载MTX超声微泡可以使孕鼠胎盘细胞的凋亡增加，抑制其增殖能力。其作用机制可能是通过调控细胞凋亡与侵袭相关的多个蛋白和基因的表达水平。为胎盘滋养细胞相关疾病治疗提供了理论支持及新的方向。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 载MTX超声微泡制备及一般特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 载MTX超声微泡联合超声靶向微泡破裂对人滋养细胞作用的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 聚焦超声联合载MTX超声微泡对孕鼠胎盘作用的实验研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述

致谢

攻读博士学位期间发表论文及参与课题