肺表面活性蛋白SP-B定位及模拟肽生物活性初步研究

摘要

疏水性肺表面活性蛋白B（SurfactantproteinB,SP-B）是发现最早的肺表面活性蛋白，能够与肺泡表面的磷脂相互作用形成稳定的肺表面活性物质(puLmonarysurfactant,PS)分子层，从而维持肺泡形态和良好的肺顺应性。近年来肺表面活性物质逐渐成为治疗急性肺损伤(AcuteLungInjury,ALI)的重要药物之一。现上市的肺表面活性物质绝大多数为天然提取物，主要成分为肺表面活性蛋白与磷脂的混合物，SP-B是其发挥重要作用的成份之一。但由于原料来源的局限、生产的高成本、以及可能会发生免疫反应和细菌感染等因素限制了其临床的应用。因此，人工合成其关键成份是近年研究的趋势。　　研究目的：　　本研究在深入了解大鼠SP-B定位以及其序列电荷分布、二级结构和疏水性特点的基础上，设计和筛选最佳SP-B模拟肽结构。人工合成SP-B模拟肽，并对合成的SP-B模拟肽体外活性、对脂质构象和功能的影响、对大鼠离体肺顺应性的作用等进行测定，旨在为进一步深入研究开发人工肺表面活性物质奠定基础。　　研究方法：　　①SP-B蛋白的定位研究：利用免疫荧光技术检测SP-B蛋白在肺组织中定位。利用基因重组方法构建质粒pEGFP-N2-SP-B，并通过脂质体转染至CCL-149与A549细胞系。　　②模拟肽的设计、筛选与合成：通过生物信息学工具对模拟肽设计、筛选并采用标准的Fmoc固相化学合成方法合成。　　③模拟肽的体外活性初步测定：利用脂质体构建模拟膜，采用Wilhelmy式膜天平对模拟肽体外初步活测定。　　④模拟肽与脂质相互作用研究：利用拉曼光谱测定模拟肽对脂质反式与扭曲等构象信息的变化情况。　　⑤体内活性研究：建立大鼠离体肺灌洗模型，肺内滴注模拟肽制剂，测定大鼠离体肺顺应性。　　研究结果：　　①利用免疫荧光确定了SP-B蛋白在肺组织中定位。成功构建了pUC-T-SP-B与pEGFP-N2-SP-B重组质粒，测序结果正确。质粒转染结果显示SP-B在A549细胞系中主要定位于细胞质中，而在CCL-149细胞系中主要定位于细胞核与细胞膜上，SP-B有可能为膜蛋白。　　②通过生物信息学工具设计、筛选出了模拟肽KAAVV。委托吉尔生化公司合成多肽，HPLC结果显示纯度达到98.6％，质谱分子量结果与理论值一致。　　③成功构建脂质体模拟膜，初步体外活性测定显示其能够有效降低气液表面张力。　　④拉曼光谱分析结果显示在加入多肽后，使DPPC与DPPG的C-C骨架有序性构象降低，链间无序性增强。C-H的伸缩振动表明，加入多肽后增强双层膜的流动性，显示出了SP-B在PS中的所起到的作用。　　⑤离体静态肺顺应性测定结果显示模拟肽制剂能够明显提高肺顺应性。

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英文缩略表

1. 引 言

1.1 研究背景及意义

1.2 研究现状

2. SP-B蛋白在肺组织中的定位

2.1 材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4讨论

3. pEGFP-N2-SP-B载体构建与细胞转染

3.1 材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4. SP-B生物信息学分析及其模拟肽设计

4.1 主要工具

4.2 设计依据

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5. SP-B模拟肽的体外活性与功能分析

5.1材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

6. 模拟肽对离体肺功能影响的评估

6.1 材料与方法

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

7. 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

致谢

参考文献

附录