电化学DNA传感器（阵列）的研制及其在病原微生物检测中的应用研究

摘要

目的:建立一种检测病原微生物的丝网印刷型DNA生物传感器,具有检测快速、灵敏度高、成本低、制备工艺简单等特点。本研究采用丝网印刷技术制备了传感电极,通过控制电位法固定DNA探针用于病原微生物的分型及其在样品中含量的检测。为样品中病原微生物含量的快速测定提供了一种快速,灵敏及价格低廉的检测技术,也为建立新的微生物分子分型手段提供了初步依据。　　方法:本文将单链DNA(ssDNA)固定到丝网印刷碳电极上构成电化学DNA传感器,采用电化学指示剂,建立DNA杂交的检测方法。Co(phen)33+电化学指示剂通过钴盐与配体邻菲罗啉络合制备,采用等离子发射光谱法(ICP-AES)和核磁共振法(NMR)表征功能基团,采用循环伏安法(CV)分析指示剂的电化学特性,并以此为基础研究ssDNA在电极表面的固定及DNA杂交过程。本文探讨了直接吸附、静电吸附与键合等三种ssDNA在电极表面的固定方法。　　结果:　　(1)制备了丝网印刷型传感电极,该电极制备重复性好、表面重现性好。作为电化学检测的背景信号响应较低,且稳定。制备了电化学指示剂Co(phen)33+。通过等离子放射光谱和核磁共振1H谱检测表明,Co元素和1,10-邻菲罗啉所发生的络合反应正确。在不同修饰电极上的电化学表征结果表明,Co(phen)33+在dsDNA修饰电极表面具有更好的吸附效果。　　(2)静电吸附法和键合法具有较高的ssDNA固定量,采用静电吸附法固定探针的电极杂交目标DNA后,Co(phen)33+易于嵌入双链DNA(dsDNA)中,CV峰电流(ip)信号随目标DNA浓度增加。本文采用静电吸附ssDNA的电极检测DNA杂交,实验表明,当探针固定液中ssDNA浓度为5 mg/L时,目标DNA浓度在6.65×10-8-4.26×10-6 mol/L范围内,Co(phen)33+在dsDNA修饰电极上ip值与DNA浓度呈良好的线性关系,R2为0.9819。　　(3)通过PCR和凝胶电泳技术验证了inl A、act A和hly A三个基因在单增李斯特局上的特异性,以及检测的敏感性为9.2×102 cfu/mL;通过基因序列的测定和比对,设计了act A基因检测的DNA探针5'- AGT TAC AGA AAG AAA TAA AGA GG-3'。　　在9.2×101 cfu/mL-9.2×105 cfu/mL浓度范围内,绘制了inl A、act A和hly A三个基因的荧光定量PCR检测的标准曲线,三条线性的相关系数分别为0.987、0.98和0.991。　　电化学指示剂MB在DNA杂交之后,对ip的响应无法与DNA浓度之间形成比例关系;采用电化学指示剂Co(phen)33+成功绘制了DNA杂交检测的标准曲线,线性方程为y=0.223Ln(x)+3.7843,线性相关系数为R2=0.9871;利用杂交标准曲线对样品进行定量检测计算,检出结果与荧光定量PCR检测结果相符合,误差均小于10％。　　结论:建立了一种用于病原微生物DNA检测的丝网印刷型传感器法检测技术。该技术对短链DNA和基因组DNA的检测均具有较高的灵敏度,为病原微生物的检测和分型技术提供了新的选择。

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第一章 绪论

1.1 引言

1.2 病原微生物的分型技术

1.3 电化学DNA传感器的分类与界面修饰

1.5 DNA电化学生物传感器的应用

1.6 总结与展望

第二章 丝网印刷电极和电化学指示剂的制备与表征

2.1 引言

2.2 丝网印刷电极的制备

2.3 电化学杂交指示剂Co(phen)33+的合成与表征

2.4 Co(phen)33+与丝网印刷电极及修饰电极的相互作用

2.5 本章小结

第三章 电化学DNA传感器对短链DNA检测方法研究

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.3 实验结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 基因组DNA检测方法研究

4.1 引言

4.2 目标基因特异性研究和DNA探针的设计

4.3 荧光定量PCR检测方法的建立

4.4 电化学DNA传感器检测方法的建立

第五章 结论

参考文献

致谢

附录