人肝再生增强因子结合肽的筛选、表达及功能研究

摘要

目的：人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration，hALR)是肝脏再生过程中的一个重要调控因子，在肝损伤修复过程中发挥重要作用，但有关它在肝再生过程中的分子生物学机制尚未完全明确。本研究拟从人QGY肝癌细胞cDNA文库中筛选出可能与hALR发生相互作用的蛋白质，并对之进行鉴定、克隆和生物学功能的初步研究，将有助于阐明hALR的信号传导机制，进而为阐明肝脏损伤与再生的分子生物学机制提供理论基础。 方法： 1．hALR结合肽的筛选以hALR为靶蛋白，从人肝癌细胞cDNA噬菌体展示文库中筛选与hALR相互作用的特异噬菌体克隆；对获得的特异噬菌体克隆进行PCR及ELISA鉴定，并对获得的cDNA插入片段进行测序和生物信息学分析；利用<'3>H-TdR掺入法测定hALR联合阳性噬菌体克隆对QGY肝癌细胞株的增殖效应。 2．用RNA干扰技术研究hALR与citron kinase的相互关系采用细胞免疫化学、共聚焦显微镜及RT-PCR方法检测QGY细胞胞中citron kinase的表达情况及与hALR的关系；设计并合成了三条针对citron kinase不同靶位的siRNA片段，用脂质体转染法瞬时转染细胞后48h，分别用real-time RT-PCR法检测citron kinase的mRNA水平变化，western blot法检测citron kinase蛋白水平的变化以及用细胞免疫化学、共聚焦显微镜观察QGY细胞中citron kinase表达变化的情况；利用<'3>H-TdR掺入法检测RNA干扰48h后，hALR刺激QGY细胞的增殖情况。 3．GST-hALRIP融合蛋白的构建、表达及功能研究用PCR法从与hALR具有相互作用的特异噬菌体cDNA克隆中扩增出hALR相互作用肽(hALRIP)的DNA片段，并将其亚克隆入质粒pGEX-4T-2中；重组质粒pGEX-4T-2-hALRIP被转化入宿主菌BL21(DE3)中，在IPTG诱导下进行表达；表达产物GST-hALRIP融合蛋白采用Glutathione Sepharose 4B亲合层析法纯化；用pull-down实验验证GST-hALRIP融合蛋白与hALR在体外的相互作用；采用<'3>H-TdR掺入法检测GST-hALRIP融合蛋白对hALR刺激QGY细胞增殖活性的影响。 结果： 1．hALR结合肽的筛选 (1)人肝癌细胞cDNA噬菌体表面展示文库经过四轮筛选后，噬菌体的富集效果(即噬菌体的产率)从2.9×10<'3>上升到了9.0×10<'-1>，表明特异性结合噬菌体得到了明显富集。 (2)通过ELISA方法检测所筛选到的阳性噬菌体克隆在不同稀释度时与包被在酶标板上的hALR的结合性，结果显示，在包被了hALR的孔中，A495nm吸光值随着噬菌体数量的增加而增加，说明所筛选到的阳性噬菌体克隆与hALR的结合是特异的，且呈剂量依赖关系。 (3)对四轮筛选后得到的噬菌体克隆进行PCR扩增，均扩增出约300bp的cDNA插入片段，测序结果显示序列完全一致，表明通过四轮筛选后与hALR有相近亲和力的特异性噬菌体得到大量富集。 (4)将所获得的hALR相互作用肽(hALRIP)序列信息在NCBI的EST数据库中进行同源性比较，发现与人citron kinase mRNA部分序列同源性达100％。根据跨膜蛋白预测分析软件分析，hALRIP序列位于citron kinase开放阅读框架(ORF)N端第1846～2057位碱基之间，即598～668氨基酸位置，不在citron kinase的跨膜区位置。 (5)将不同滴度四筛后噬菌体液与hALR混合后同时作用于QGY细胞，观察到显著促增殖效应，且明显高于单独的hALR组(F=29.28，p<0.01)；而混合hALR的不同滴度的对照噬菌体组与单独的hALR组间比较无显著性差异(F=0.638，p>0.05)，提示筛库获得的阳性噬菌体展示肽与hALR之间有协同效应。 2．用RNA干扰技术研究hALR与citron kinase的相互关系 (1)RT-PCR结果显示人肝癌细胞QGY中有citron kinase表达；细胞免疫化学、共聚焦显微镜观察显示citron kinase主要分布在QGY细胞的胞浆和胞核中，在细胞分裂期则位于分裂沟及中间体位置；并且QGY细胞经hALR刺激后，citron kinase的表达量明显增加，说明hALR能促进QGY细胞中citron kinase的表达，两者之间存在着相关性。 (2)成功构建和合成了三条针对citron kinase基因上不同靶位点的siRNA片段，其中靶序列1和2是针对hALRIP序列，并成功转染QGY细胞；real-time RT-PCR结果显示转染48h后三条siRNA片段均能有效抑制citron kinase基因的表达，mRNA的表达水平分别只相当于抑制前的37.89％、22.69％和26.61％，再一次证明hALRIP片段为citronkinase上的一段；western blot和激光共聚焦显微镜结果显示三条siRNA均能有效抑制citron kinase蛋白的表达，与抑制citron kinase的mRNA表达程度相符，表明siRNA抑制mRNA水平和抑制蛋白表达的程度显著相关。 (3)<'3>H-TdR掺入法测定转染siRNA片段48h后，hALR刺激QGY细胞增殖的cpm值分别为4639±382、3060±201和3576±425，与转染阴性对照组(7007±156)和空白组(7566±1009)相比，有显著性差异(p<0.05)，其中siRNA2抑制作用最明显，但三组间无显著性差异，表明hALR刺激QGY细胞增殖是通过citron kinase发挥作用的，citron kinase是hALR的下游因子，只要阻断citron kinase的表达就能阻断hALR的促增殖作用。 3．GST-hALRIP融合蛋白的构建、表达及功能研究 (1)成功构建了hALRIP的重组质粒pGEX-4T-2-hALRIP，并经酶切、PCR和测序鉴定完全正确。 (2)重组质粒pGEX-4T-2-hALRIP在宿主菌BL21(DE3)中得到高效表达，GST-hALRIP融合蛋白分子量约为33 kd，与预计理论值相符合；表达的目的蛋白主要存在于包涵体内，部分存在于细菌破碎上清中；通过Glutathione Sepharose 4B亲合纯化得到的目的蛋白经SDS-PAGE鉴定为单一条带，蛋白定量为103.2μg/ml。 (3)pull-down实验结果显示GST-hALRIP融合蛋白与hALR蛋白之间有结合作用，而GST与hALR蛋白之间没有结合作用，表明hALRIP蛋白与hALR之间在体外存在有相互结合作用。 (4)<'3>H-TdR掺入法检测GST-hALRIP融合蛋白对hALR刺激QGY细胞增殖活性的影响结果显示，GST-hALRIP融合蛋白和空载体表达的融合蛋白在高浓度时均能显著抑制hALR的促QGY细胞增殖效应(p<0.05)，并且两者之间无差异(p>0.05)，结果未能反映出GST-hALRIP融合蛋白与hALR结合的特异性。 结论： 1．从人肝癌细胞cDNA噬菌体表面展示文库中成功筛选出hALR结合肽hALRIP。 2．证实hALRIP片段为citron kinase上的一段。 3．QGY细胞中有citron kinase的表达，hALR能促进citron kinase的表达。 4．成功构建和合成citron kinase的siRNA片段，并能有效抑制QGY细胞中citron kinase基因的表达。 5．hALR刺激QGY细胞增殖是通过citron kinase发挥作用的。 6．重组GST-hALRIP融合蛋白的高效表达和成功纯化为进一步的功能性研究奠定了基础。 7．hALRIP蛋白与hALR在体外存在着相互结合作用。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一章从人肝癌细胞cDNA表达文库筛选hALR结合肽的研究

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第二章siRNA抑制人肝癌细胞QGY中citron kinase基因表达的作用

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第三章GST-hALRIP融合蛋白的构建、表达及与hALR相互作用的初步研究

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文小结

文献综述 细胞因子与肝细胞癌

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文