不同接头的白蛋白干扰素α-2b在毕赤酵母中表达量及生物学活性研究

摘要

目的：人血清白蛋白是血浆中含量较高的一种蛋白，在体内能够与许多物质结合，同时白蛋白也是一些药物的良好载体。在体内可以有效的延长药物的半衰期，而且也不会对机体产生免疫原性。本实验主要是通过构建不同接头的pPIC9K-HSA-IFNα-2b，然后用salⅠ酶线性化，电转化Pichia.PastorSMD1168，将阳性转化子在合适的条件下，用甲醇诱导表达，取上清进行SDS-PAGE、Western-Blot鉴定，再用酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合白蛋白干扰素的表达量，最后用细胞病变抑制法(Wish细胞-VSV病毒)测定其抗病毒活性。
　　 方法：在白蛋白与干扰素之间通过重叠PCR获得不同的接头的白蛋白干扰素，接头的氨基酸数分别是15、10、5，在相同的条件下，先对每一种接头的白蛋白干扰素进行诱导表达，筛选出表达量最高的一个，然后分别取三种表达量最高的克隆在相同的条件下甲醇诱导表达，分别测定表达量，比较大小。根据表达量的差异，用500mL摇瓶培养，初步分离纯化蛋白，最后再用细胞病变抑制法测定其活性大小，分别计算出比活。
　　 结果：通过重叠PCR构建的三种接头蛋白的重组子，在毕赤酵母中表达，15个氨基酸linker、10个氨基酸linker、5个氨基酸linker的表达蛋白浓度分别是194mg/L、135mg/L、177mg/L。三种接头的白蛋白干扰素比活差异较小，比干扰素α-2b的比活低了很多，可能是白蛋白的存在影响了干扰素α-2b的活性位点。
　　 结论：我们发现15个氨基酸接头蛋白的白蛋白干扰素表达量最高，其次是5个氨基酸接头的，在白蛋白与干扰素之间用一个柔性肽进行连接(GGGGS)，15个氨基酸接头的连接肽为(GGGGS)3，10个氨基酸接头的连接肽为(GGGGS)2，这些研究对工业化生产有一定的理论指导作用。