茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植通过HMGB1/TLR4信号通路对急性肝衰竭大鼠的影响

摘要

目的：观察茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠HMGB1、TLR4及炎症因子表达的影响，探讨其治疗急性肝衰竭的疗效及可能机制。　　方法：（1）骨髓间充质干细胞制备：采用全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞，予以换液、传代，当细胞培养至第3代时行细胞表型鉴定，予以储存备用。（2）分组造模：取65只SD大鼠，从中随机选取50只大鼠用于造模，平均分为模型组、中药组、干细胞组、甘草酸苷组、联合组，予以硫代乙酰胺（TAA）300mg/kg腹腔注射，每天1次，连续3天给药。其余15只大鼠平均分为正常组、正常中药组、正常干细胞组予以等生理盐水腹腔注射。（3）干预治疗：开始造模后中药组、正常中药组及联合组予以茵陈四苓颗粒1.5g/kg灌胃，每天2次，甘草酸苷组予以复方甘草酸苷片15mg/kg灌胃，每天2次。其余大鼠予以等生理盐水灌胃。造模开始后12小时以内正常干细胞组、干细胞治疗组及联合治疗组予以干细胞干预，调整干细胞浓度为1×107/ml，制备成干细胞悬液予以门静脉注射。其余各组均予以等生理盐水门静脉注射。（4）取材检测：于造模成功后24h麻醉大鼠，腹主动脉采血，取肝组织。全自动生化仪检测肝功能ALT、AST、TBIL；内毒素测定仪检测血浆内毒素；HE染色观察肝脏组织病理改变；酶联免疫吸附法（ELISA）法检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β的表达；免疫蛋白印迹分析（Western blot）检测肝组织TLR4、HMGB1蛋白的表达。　　结果：（1）、采用全骨髓贴壁法成功培养出骨髓间充质干细胞，经换液传代后细胞纯度提高，第3代干细胞多数呈长梭形，形态趋于稳定，细胞表型鉴定提示低表达CD45（18.5%）、CD34（12.9%），高表达CD44（99.7%）、CD29（98.7%）。符合骨髓间充质干细胞特性。(2)、肝功能及内毒素结果：TAA造模成功后24小时，各造模组肝功能ALT、AST、TBIL及血浆内毒素显著升高，模型组升高最明显，经中药、干细胞、甘草酸苷、联合治疗后各治疗组转氨酶、胆红素及血浆内毒素较模型组下降，且以联合组效果佳，各治疗组与模型组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。联合组与中药组、干细胞组、甘草酸苷组相比差别具有统计学意义（P＜0.05）。(3)、病理结果：模型组大鼠肝脏结构紊乱，汇管区大量炎性细胞浸润，呈弥漫片状坏死，部分为桥接样坏死，部分细胞水肿。给予中药、干细胞、甘草酸苷及联合组治疗的的大鼠肝脏炎性细胞浸润及肝细胞坏死程度较模型组有所减轻，可见许多正常的肝细胞，以联合治疗组更显著。给予单纯中药及单纯干细胞干预的大鼠肝脏结构正常，未见肝细胞坏死及炎性细胞浸润。(4)、ELISA检测结果：造模后各干预组TNF-α、IL-6、IL-1β较正常组明显升高，其中以模型组最显著。经干细胞、中药、甘草酸苷及联合干预的大鼠的TNF-α、IL-6、IL-1β较模型组有所下降，以联合组最明显，各治疗组与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。联合组的TNF-α、IL-6、IL-1β与中药组、干细胞组、甘草酸苷组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。(5)、Western Blot检测结果：造模后各组HMGB1、TLR4蛋白水平较正常组明显升高，且以模型组升高最显著。经中药、干细胞、甘草酸苷及联合治疗干预后，各组HMGB1、TLR4蛋白表达水平较模型组有所下降，各治疗组与模型组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。联合治疗组HMGB1、TLR4下降更明显，联合组与中药组、干细胞组、甘草酸苷组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：（1）SD大鼠给予TAA300mg/kg腹腔注射，每天1次，连续3天,能成功建立急性肝衰竭模型；（2）茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭大鼠可以减轻肝脏炎症及损伤，两者联合用药效果优于单用；（3）茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭大鼠可能通过下调HMGB1、TLR4表达水平，下调下游TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达减轻肝脏炎症，发挥治疗作用。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物

1.2. 实验药物

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

4.1骨髓间充质干细胞提取、培养、传代及鉴定

4.2.实验分组及干预

4.3 检测血清AST、ALT、TBIL及血浆内毒素

4.4 肝组织切片HE 染色

4.5 酶联免疫吸附法(ELISA)法检测 IL-6、IL-1β、TNF-α的表达，操作按照ELISA试剂盒说明书进行

4.6 免疫蛋白印迹分析检测各组大鼠肝组织TLR4、HMGB1蛋白

5 统计分析

结果

1 BMSCs的生长状态及鉴定

1.1 BMSCs的生长情况及形态

1.2BMSCs的表型鉴定

2急性肝衰竭大鼠模型的建立，各组大鼠一般情况。

1.1一般情况

1.2大鼠死亡情况

3各组大鼠肝功能ALT、AST、TBIL以及血浆内毒素结果

4各组大鼠HE光镜结果

5各组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β的比较

6干预后对各组大鼠肝脏组织HMGB1、TLR4蛋白表达的影响

讨论

1 急性肝衰竭大鼠模型的建立

2 HMGB1/TLR4在急性肝衰竭中的作用

3 TNF-α、IL-1β、IL-6在急性肝衰竭中的作用

4 中医药在急性肝衰竭中的应用

5 茵陈四苓颗粒对急性肝衰竭大鼠的影响

6 BMSCs对急性肝衰竭炎症的影响

7 茵陈四苓颗粒联合BMSCs对急性肝衰竭大鼠HMGB1/TLR4信号通路的影响

本实验不足之处

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

综述:间充质干细胞治疗肝衰竭的研究现状及展望

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