紫杉醇纳米粒联合时辰化疗诱导肺癌细胞凋亡与Per2基因表达相关性的体内外研究

摘要

目的：采用三嵌段聚合物聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯（poly(ε-caprolactone)-poly(ethyleneglycol)-poly(ε-caprolactone)(PCL-PEG-PCL，PCEC）)负载的紫杉醇（Paclitaxel，PTX）纳米粒（PTX-NPs）已经被证实对肺癌细胞有较强的抗癌效果。在课题组前期的研究中已经证明，运用时辰给药的原理在一天中的不同时间点采用PTX-NPs对肺癌细胞进行化疗，抗癌效果显示出了明显的差异性，其中在光照射15小时后(15Hours After Light Onset，15HALO)处理肺癌细胞抗癌活性最强，而0HALO抗癌活性最弱。然而，导致PTX-NPs在不同时间点处理肺癌细胞效果存在差异的原因尚不明确。因此，在本研究中，试图通过对肺癌细胞Per2基因表达规律的探索，去观察Per2基因在一天中的昼夜表达水平是否存在差异性；并探究这种差异性与时辰化疗抗癌活性之间是否存某种关联，从基因层面去解答肺癌细胞时辰化疗后抗癌效果存在差异性的原因。　　方法：体外实验部分，将培养至对数生长期的A549细胞分组（空白对照组，PTX组，PTX-NPs组）。三组分别在0HALO、5HALO、10HALO、15HALO、20HALO给予化疗药物干预（空白对照组给予细胞完全培养液）。在干预48小时后分别收集各组细胞固定好，用流式细胞技术检测各组A549细胞中G2期细胞所占比率和细胞凋亡比率，用蛋白印迹试验（western blot，WB）和实时荧光聚合酶链反应实验（Real-Time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测Per2基因的表达水平。动物实验部分，首先将购买的裸小鼠分为三个大组（分组方法同体外实验为空白对照组，PTX组和PTX-NPs组，空白对照组给与同等量体积的生理盐水），然后每个大组内根据0HALO、5HALO、10HALO、15HALO、20HALO五个处理的时间点再分为5个亚组。均在光照-黑暗24小时循环的环境下饲养3周，使所有裸小鼠建立起相同的生物昼夜节律性。再将培养至对数生长期的A549肺癌细胞与细胞完全培养液混悬后种植于裸小鼠右侧大腿外侧的皮下，构建起异种移植瘤裸小鼠的动物模型。7-14天后，肿瘤体积逐渐长大至100mm3左右后，依次在五个时间点对裸小鼠进行干预，每隔3天一次，共给药3次。给药处理后每两天通过游标尺测量裸小鼠肿瘤长短径，借助公式，计算肿瘤体积，绘制出给药后各组裸小鼠皮下移植瘤的生长曲线。药物干预结束12天后通过颈椎脱臼法将各组裸小鼠处死，然后剥离肿瘤组织，称取重量，并计算肿瘤生长抑制率。剥离裸小鼠心、肝、脾、肺、肾，进行病理切片用苏木精伊红染色(hematoxylin—eosin，HE)观察裸小鼠时辰化疗后内脏器官损伤情况。采用western blot法和RT-PCR法检测各组肿瘤细胞Per2、Bax、Bcl-2基因的表达情况。　　结果：体外实验部分，A549细胞以15HALO给予药物处理化疗效果最优（P＜0.01），0HALO化疗效果最差。A549细胞Per2基因的表达水平以15HALO最高（P＜0.01），0HALO最低，呈24小时周期性变化。动物实验部分，肺癌异体移植瘤模型的时辰化疗以15HALO给药肿瘤生长最缓慢，肿瘤生长抑制率最大（P＜0.01）。Bax基因的表达水平以15HALO最高，0HALO最低。Bcl-2基因的表达水平以0HALO最高，15HALO最低。Per2基因的表达水平以15HALO最高（P＜0.01），0HALO最低，呈24小时周期性变化。HE染色结果提示PTX和PTX-NPs的内脏损害以肝脏为主，以15HALO组损害相对最轻，0HALO组损害相对最大。　　结论：PTX-NPs采用时辰给药的方式治疗肺癌A549细胞，抗癌效果存在昼夜差异性。该差异性与生物钟基因Per2的表达状态呈正相关。Per2基因或许能成为肺癌个体化时辰化疗的参考指标。

目录

前言

材料与方法

第一部分 PTX-NPs制备

1 实验材料

2 实验方法

1 实验材料

2 实验方法

第三部分 PTX-NPs对肺癌细胞时辰化疗与Per2基因表达的体内研究

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 PTX-NPs的理化特性

2 PTX-NPs时辰化疗后A549细胞周期和凋亡的体外研究

3 Per2基因表达规律的体外研究

4 PTX-NPs联合时辰化疗对肺癌异体移植瘤疗效的早期评价

5 PTX-NPs联合时辰化疗诱导肺癌异体移植瘤细胞凋亡的研究

6 Per2基因表达规律的研究

7 PTX-NPs时辰化疗对内脏器官影响的观察

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

研究成果

综述:紫杉醇纳米粒联合时辰化疗诱导肺癌细胞凋亡与Per2基因表达相关性的体内外研究

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