双黄连影响兔组织笼感染模型中左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌的耐药突变选择及grlA、grlB、gyrA、gryB基因突变的作用

摘要

目的:探讨高中低剂量双黄连联用左氟沙星与单用左氧氟沙星作用于感染动物体，对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MSW及grlA、grlB、gyrA、gyrB基因突变的影响。以期为中药改善喹诺酮类药物耐药提供科学依据，为临床减少细菌耐药性的产生提供一种新的治疗途径。　　方法:建立兔组织笼模型，以金黄色葡萄球菌ATCC29213感染，分为生理盐水阴性对照组，单用左氧氟沙星组(10mg·kg-1·d-1)，单用双黄连组（85mg· kg-1·d-1）,低剂量双黄连联用左氧氟沙星组(双黄连42.5mg· kg-1·d-1+左氧氟沙星10mg· kg-1·d-1)，中剂量双黄连联用左氧氟沙星组(双黄连85mg·kg-1·d-1+左氧氟沙星10mg·kg-1·d-1)，高剂量双黄连联用左氧氟沙星组(双黄连170mg·kg-1·d-1+左氧氟沙星10mg· kg-1·d-1)，耳缘静脉注射，连续给药5天，比较低、中、高剂量双黄连联用左氧氟沙星与单用左氧氟沙星干预过程中，不同时间不同组别金黄色葡萄球菌浓度变化曲线。抽取6组干预不同时间不同组别兔组织笼内金黄色葡萄球菌增菌培养，增菌培养后，采用琼脂平板二倍稀释法测定连续7天（干预过程中和干预结束后两天）相同时间点各组最低抑菌浓度(MIC)、防耐药突变浓度(MPC)、联合抑菌指数(SI=MPC/MIC)。以细菌菌落数、MIC、MSW(SI=MPC/MIC)作为统计学指标，用SPSS19.0软件通过重复测量方差分析方法进行统计学分析，并用LSD进行组间两两比较。提取干预结束后两天组织笼内恢复生长的细菌DNA，应用PCR技术扩增野生型金黄色葡萄球菌和干预后兔组织笼内金黄色葡萄球菌，采用双脱氧末端终止法测定和DNAMAN软件分析grlA、grlB、gyrA、 gyrB基因序列，比较金黄色葡萄球菌ATCC29213及6组不同干预组兔组织笼内金黄色葡萄球菌grlA、 grlB、 gyrA、 gyrB基因序列突变情况与细菌耐药性的关系。　　结果:细菌菌落计数表明:生理盐水阴性对照组的细菌菌落在10log10CFU·mL-1上下波动。而其他各组菌落曲线均位于阴性对照组下方，用LSD进行两两比较的结果显示阴性对照组与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。单用双黄连组第一至四天呈缓慢下降趋势，下降至6log10CFU· mL-1水平维持波动。单用左氧氟沙星组第一至第四天细菌数量急剧下降至4log10CFU·mL-1，第五天有较大回升至6log10CFU· mL-1左右波动。不同浓度双黄连联用组在第一至五天菌落数均急剧下降，降至3log10CFU·mL-1和2 log10CFU·mL-1水平维持波动，高浓度联用组第五天未检测到存活的菌落，菌落在停用药后两天均无回升趋势。随联用双黄连的剂量增加，菌落下降趋势增大，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。细菌MIC分析结果表明:阴性对照组MIC在0.146±0.015ug·mL-1附近有微弱波动，无明显变化。单用左氧氟沙星组在第二天MIC出现急剧升高，由初始MIC(0.146±0.015ug·mL-1)于第三天上升至1.000±0.122ug·mL-1即上升了约7倍，连续7天MIC整体处于上升趋势终至1.236±0.061ug·mL-1，即最终上升了约9倍，与阴性对照组相比有统计学差异(P＜0.05)。单用双黄连组曲线处于阴性对照组下方，但变化不大，无统计学差异(P=0.422＞0.05)。三组双黄连联用组MIC曲线均位于阴性对照组MIC曲线下方，与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。低剂量联用组前三天MIC在初始MIC附近变化不大，之后降低至0.119±0.063ug· mL-1附近波动。中剂量联用组第二天开始出现MIC降低，MIC降低至0.048±0.011 ug·mL-1,附近波动。高剂量联用组于第二天MIC出现急剧下降，第四天MIC降低至0.036±0.018ug·mL-1,即下降了约3.9倍，第五、六、七天未检测到细菌。随联用的双黄连的剂量增大，MIC降低的趋势增大，差异有统计学意义(P＜0.05)。且中剂量联用组和高剂量联用组相对低剂量联用组MIC降低的时间明显提前一天。细菌MSW分析结果表明:阴性对照组MSW在初始10.509±0.027附近有微弱波动，前后无明显变化。单用左氧氟沙星组第二天MSW出现急剧升高，由初始10.546±0.060增大至21.502±0.472左右波动。与阴性对照组比较，MSW整体呈上升趋势，差异均有统计学意义(P＜0.05)。单用双黄连组曲线位于阴性对照组上方，但相差不大，无统计学差异(P=0.422＞0.05)。三组双黄连联用组MSW曲线均位于阴性对照组MSW曲线下方，与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。低剂量联用组前两天在初始MSW(10.609±0.092)附近变化不大，第三天出现急剧下降第四天降低至7.604±0.083微弱波动。中剂量联用组第二至五天MSW均处于明显持续下降趋势最终至3.246±0.096附近微弱波动。高剂量联用组MSW于第二至四天急剧下降至2.254±0.049，第五、六、七未检测到细菌。随联用的双黄连的剂量增大，MSW降低的趋势增大，差异有统计学意义(P＜0.05)，且中剂量和高剂量联用组相对低剂量联用组MSW降低的时间明显提前一天。金黄色葡萄球菌ATCC29213和6组干预组兔织笼内金黄色葡萄球菌的grlA、grlB、gyrA、gyrB基因的分析结果表明:金黄色葡萄球菌ATCC29213，生理盐水阴性对照组，双黄连联用组，单用双黄连组grlA、 grlB、gyrA基因序列一致，单用左氧氟沙星组grlA基因序列发生了多处突变，grlB、gyrA基因序列发生了两处点突变。grlA密码子突变位点:Ala(29)→Ser, Ser(32)→Val,Asn(40)→Ala54,Gln(54)→Asn,Phe(61)→Ser,Asp(73)→Thr,His(78)→Asn,Ile(81)→Val,Ile(90)→Val,Asn(92)→Gly,Pro(95)→Ala,Lys(104)→Arg,Lys(104)→Arg,Leu(107)→Pro,Leu(108)→Ile,Ile(116)→Leu,Ser(123)→Glu,Ile(125)→Val,Pro(126)→Ser,Tyr(128)→Phe,Thr(132)→Ser, Leu(133)→Glu,Ser(139)→Ala,Arg(140)→Ala,Asp(159)→Glu，Asn(165)→His，Tyr(175)→Arg,Asn(178)→Lys。grlB密码子发生两处突变:Tyr(114)→Phe，Leu(115)→MET.gyrA密码子突变点:Pro(61)Pro→Thr。GyrB基因序列分析显示各实验组与ATCC29213—致。　　结论:双黄连明显降低金黄色葡萄球菌对左氧氟沙星的MSW、MIC，在一定用药范围内，越高浓度双黄连与左氧氟沙星联用，以上作用越强，因此联合使用双黄连可以增强左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌耐药敏感性。左氧氟沙星引起细菌耐药性的产生可能与grlA基因中的多处点突变和grlB、gyrA的两处点突变有关，可能与gyrB基因无关。中药双黄连能抑制左氧氟沙星诱导产生的金黄色葡萄球菌grlA、grlB、gyrA的突变，从而降低细菌耐药性。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

结果

1 兔组织液中细菌菌落数的变化趋势测定

2 兔组织液中细菌MIC的变化趋势测定

3 兔组织液中细菌MSW的变化趋势测定

4 金黄色葡萄球菌耐药基因grlA、grlB、gyrA、gyrB的PCR扩增结果

5 6组实验组金黄色葡萄球菌与金黄色葡萄球菌ATCC29213 grlA、grlB、gyrA、gyrB基因的序列分析结果

讨论

1 双黄连影响兔组织笼感染模型中左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌的耐药突变选择的作用

2．双黄连影响兔组织笼感染模型中左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌grlA、grlB、gyrA、gyrB基因突变的作用

结论

参考文献

英汉缩略名词对照表

致谢

诺酮类药物耐药机制及其研究进展 综述

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