脑胶质瘤新生血管变化特征与动态对比增强磁共振成像实验研究

摘要

背景和目的:　　胶质瘤是威胁人类健康的恶性程度较高的颅内肿瘤，高级别胶质瘤是新生血管最为丰富的恶性肿瘤之一。新生血管是肿瘤组织内新生毛细血管产生、重塑，并形成相对成熟血管的过程，包括血管共生(Vascular co-option)、血管生成(Angiogenesis)、血管发生(Vasculogenesis)、马赛克样新生血管形成(Mosaic vessel formation)、血管拟态(Vascularmimicry)和胶质母细胞瘤内皮转分化(Glioblastoma-endothelial cell transdifferentiation)等类型。胶质瘤新生血管的类型和数量在肿瘤发生、发展过程中存在显著的差异，不同类型的胶质瘤新生血管对抗肿瘤药物以及抗血管生成治疗的敏感性不同，研究新生血管在胶质瘤生长过程中的动态变化特征对制定更加有效的抗肿瘤治疗方案有积极的促进作用。　　磁共振成像(Magnetic resonance imaging)技术可以无创的对活体组织进行重复监测，在肿瘤诊断、疗效监测等方面发挥重大作用。动态对比增强磁共振成像(Dynamiccontrast-enhanced MRI，DCE-MRI)可以描述血管通透性、有效灌注面积等生理状态。目前已应用于恶性程度的分级、疗效监测等方面，用于新生血管的评价尚无详细的病理学及影像学的对照研究报道，其多参数的特点尚未得到完全有效的开发利用。胶质瘤新生血管在组织学上无论是数量还是类型都具有较大的异质性，新生血管对胶质瘤的恶性程度、患者的预后都有重要的影响，DCE-MRI可较好的评价胶质瘤新生血管的功能状态。　　血管出芽、血管共生、血管套叠以及血管拟态等新生血管方式随胶质瘤发生、发展过程发生动态变化。MRI可以动态监测新生血管及肿瘤细胞的生理、代谢等状态，前期工作已经证实Ktrans等参数与胶质瘤微血管密度(Microvessel density，MVD)及肿瘤分级有较好的相关性，其与新生血管类型定量参数的相关性有待进一步的证实。在本实验中，我们利用胶质瘤原位模型研究胶质瘤新生血管类型的存在形式及其动态变化过程，同时探讨DCE-MRI与新生血管组织学定量参数的相关性，为DCE-MRI显示新生血管特征和动态变化过程提供影像学与病理组织学相对应的实验依据。　　材料和方法:　　研究由胶质瘤动物模型新生血管特征的组织学分析以及胶质瘤新生血管特征与磁共振成像相关性研究两部分组成。动物模型采用三种常用的不同来源的胶质瘤模型，分别为大鼠源性的C6胶质瘤模型和人源性的U87、U251胶质瘤模型。小动物磁共振成像采用T2 WI以及DCE-MRI技术。　　1.建立C6、U87、U251胶质瘤原位模型:用量程为20μl的微量进样器吸取10μl胶质瘤细胞悬液，将注射器固定于脑立体定位仪上，垂直进入脑实质中，控制进针深度为5mm，再回退1mm，手动将胶质瘤细胞悬液缓慢注入脑实质内，控制注射时间为10min左右。注射细胞悬液完毕后留针5min，骨蜡封口。　　2.动物生存状态观察:记录每组荷瘤鼠的建模时间与死亡日期，分析、比较荷瘤鼠生存率及半数生存期。　　3.病理组织学观察:　　1) HE染色对肿瘤组织学特点进行观察;　　2) CD34、TNC、PAS-CD34免疫组织化学染色判断并定量分析胶质瘤模型新生血管的类型;　　3)α-SMA、Desmin免疫组织化学染色研究胶质瘤新生血管的成熟方式;　　4) PCNA、MMP-2免疫组织化学染色比较不同类型新生血管对肿瘤增殖、侵袭能力的影响;　　4.胶质瘤MRI动态观察　　1)观察6个时相点模型胶质瘤的常规MRI表现及DCE-MRI特征:　　2)测量6个时相点模型胶质瘤DCE-MRI相关参数，包括Ktrans、Kep、Vp;　　3)分析比较Ktrans、Kep、Vp值与新生血管类型组织学定量参数之间的相关性。　　5.统计学分析:应用SPSS18.0统计软件进行统计分析，计量资料均采用(x)±s记录。使用Kaplan-Meier法计算并绘制三种胶质瘤模型荷瘤鼠的生存曲线，Log-rank检验比较三组胶质瘤模型的半数生存期。采用one-way ANOVA方差分析比较三种模型之间组织学定量参数的差异，Ktrans、Kep、Vp及组织学定量的组间差异，t-test比较数据的组内差异。Spearman相关性分析比较MRI参数与新生血管类型定量参数的相关性并计算Pearson相关系数。规定P＜0.05有统计学意义。　　结果:　　一、脑胶质瘤原位模型新生血管组织学定量研究　　1.依照单盲实验的要求，经两位病理科医生独立诊断，参考WHO2007年胶质瘤分级的标准，明确C6、U87、U251胶质瘤模型分别对应的人胶质瘤WHOⅢ/Ⅳ的分级诊断。　　2.生存分析显示C6大鼠胶质瘤模型半数生存期为30天，U87、U251人源性胶质瘤模型的中位生存时间分别为50和53天。C6模型与其他两种胶质瘤模型的半数生存期存在统计学差异，U87、U251半数生存期不存在显著统计学差异。　　3.三种胶质瘤均具有较强的增殖能力，PCNA指数无统计学差异。　　4.三种模型新生血管均异常丰富，MVD计数无统计学差异。三种胶质瘤模型新生血管的成熟存在两种方式:一是α-SMA阳性表达的血管周细胞的募集，二是Desmin阳性的血管壁细胞的募集。U87、U251模型高表达α-SMA阳性的血管周细胞，而C6模型则更多的募集Desmin阳性的血管周细胞。　　5.TNC染色观察到三种模型中大部分肿瘤微血管通过血管出芽的方式新生。在模型生存终末期可以观察到部分肿瘤微血管存在血管套叠生成。HE染色配合CD34、GFAP免疫组织化学染色在胶质瘤瘤旁组织鉴定出血管共生现象。CD34-PAS复染鉴定出胶质瘤坏死周围存在血管拟态这种特殊的新生血管类型。除血管拟态数量无明显统计学差异外，三种模型之间血管出芽、血管套叠和血管共生均存在明显统计学差异（P＜0.05）。　　二、脑胶质瘤新生血管动态变化特征与MRI相关性研究　　1.C6胶质瘤病理表现:大体标本观察到荷瘤鼠右侧基底节区出现“鱼肉样”新生肿块组织，HE染色见肿块组织异常丰富的新生血管以及特征性“栅栏样坏死”，C6胶质瘤组织侵润性生长的区域为距肿瘤边缘约437.8±153.6μm的范围。　　2.胶质瘤新生血管存在形式和动态变化:移植细胞后第12和第16天血管共生现象最少，与其他四个时间点比较有明显统计学差异(P＜0.05)。6个时相点均显示血管出芽生长是C6胶质瘤最重要的新生血管方式，不同时相点血管出芽定量有明显统计学差异（P＜0.05）。血管套叠为在血管腔内见到柱状分隔，高倍镜下观察到血管套叠生长的三个典型阶段，即套叠式血管生成、套叠式血管扩张和套叠式血管重塑。血管套叠仅在移植细胞第8天才出现，且随肿瘤的增大而增多，不同时相点血管套叠数有统计学差异(P＜0.05)。6个时相点，血管拟态数量较少，均无明显统计学差异。　　3.胶质瘤MRI动态特点:肿瘤体积随移植推移而逐渐增大（P＜0.05）。肿瘤组织DCE-MRI灌注参数均随着肿瘤生长不断升高（P＜0.05）。瘤旁组织Ktrans、Kep随肿瘤生长出现“先升高后下降”的变化规律（P＜0.05），Vp值的变化则无显著统计学差异(P＞0.05)。　　4.MRI参数与组织学参数的相关性:瘤旁组织DCE-MRI灌注参数Ktrans和Kep与C6胶质瘤血管共生指数有较强负相关，Kep、Vp与套叠血管、血管出芽呈正相关(p＜0.05)。　　结论:　　1.三种胶质瘤原位模型中均存在四种新生血管类型，即血管出芽，血管共生，血管套叠以及血管拟态等，不同的胶质瘤模型中新生血管类型的数量不同。　　2.大鼠C6胶质瘤原位模型生长过程中，四种新生血管方式的表达数量不同，呈明显的动态变化过程。　　3.大鼠C6新生血管组织的定量参数与DCE-MRI参数有较好的相关性，MRI有望成为无创的监测胶质瘤新生血管动态变化特征的影像学标志物。

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摘要

第一章 前言

第二章 脑胶质瘤原位模型新生血管组织学定量研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 脑胶质瘤新生血管动态变化特征与DCE-MRI相关性研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 胶质瘤新生血管类型及机制

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢