枸橼酸西地那非对小鼠听力影响的实验研究

摘要

枸橼酸西地那非( Sildenafil citrate)是特异的5型磷酸二酯酶(type5 phosphosdesterase, PDE5)磷酸二酯酶抑制剂,起先研发该类药物,目的用于治疗心血管方面疾病,而后发现在治疗勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)方面有显著效果。近年来随着枸橼酸西地那非被广泛使用,其药物副作用报道也增多,2007年美国FDA根据数十例临床案例的调查结果,首次报道该类药可导致药物性听力下降。为了研究这一问题,许多研究者进行了临床流行病学调查,显示5型磷酸二酯酶抑制剂类药物与听力突然丧失有着重要关联性,其中枸橼酸西地那非发病率最高,大剂量使用发病率则高达50％。由于用药不慎而致中毒性耳聋会给患者增加更多痛苦,因此,重视该类药物的耳毒性,研究这类药物耳毒性的发病机制具有重要价值,这可以指导临床医生正确使用该类药物。目前国内外对该类药物耳毒性的研究主要以回顾性病例分析总结为主,缺乏有效动物实验研究。　　本课题拟通过动物实验,研究枸橼酸西地那非对小鼠听力的影响,建立昆明小鼠在体枸橼酸西地那非耳毒性模型,并探讨该药对听力损伤的可能机制,包括该药对耳蜗毛细胞形态、毛细胞离子通道和电生理特性的影响。为临床用药提供实验证据,指导临床正确使用该类药物。　　研究目的:　　1.通过灌胃给药,观察枸橼酸西地那非对小鼠听力的影响;　　2.应用全细胞电流钳和细胞贴附电压钳技术,观察枸橼酸西地那非对小鼠耳蜗内毛细胞电生理的影响,探讨其耳毒性机制。　　材料和方法:　　1.选择健康7周龄雄性昆明小鼠40只,随机分为4组,分别为枸橼酸西地那非低剂量组(0.1mg/(kg·d)、中剂量组(1 mg/(kg·d)、高剂量组(10 mg/(kg·d))、空白对照组,检测每组于灌胃给药第0、1、5、10、20天的听性脑干反应阈值(Auditory brain-stem response,ABR),研究枸橼酸西地那非对小鼠听力的影响;采用异硫氰基荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的免疫荧光染色方法观察昆明小鼠耳蜗毛细胞的形态改变;并用高效液相色谱分析法(High performance liquid chromatography, HPLC)检测小鼠耳蜗内淋巴液枸橼酸西地那非浓度。　　2.枸橼酸西地那非对小鼠耳蜗内毛细胞电生理影响的检测:分组如下:A组:正常组;B组:枸橼酸西地那非低剂量组。应用全细胞电流钳和细胞贴附电压钳技术,检测正常组和枸橼酸西地那非低剂量组内毛细胞(inner hair cell,IHC)的钙电流和膜电容的变化。　　结果:　　1. ABR的阈值结果显示:正常对照组20天内ABR阈值的波动较小,无明显变化;给药后1天,各组ABR阈值较正常对照组和喂药前无明显差异(未见明显统计学差异P>0.05);5天后西地那非给药组阈值则逐渐提高。西地那非各剂量组与空白对照组比较均有不同程度的听觉损伤,表现为ABR阈值上移,阈值上移程度与给药剂量有关,高剂量组较为明显,西地那非低剂量组较轻;各组随着给药时间延长,阈移逐渐增大。FITC荧光染色结果显示:绿色荧光为小鼠耳蜗毛细胞胞体,正常对照组小鼠耳蜗毛细胞即外毛细胞(outer hair cell,OHC)和内毛细胞(inner hair cell,IHC)形态正常,排列整齐,着色均匀、无缺失。西地那非低剂量组耳蜗损伤相对较轻,内、外毛细胞形态结构基本正常。西地那非中剂量组内毛细胞损伤较轻,3排外毛细胞损伤明显。西地那非高剂量组内、外毛细胞出现排列紊乱,细胞缺失,结构不完整,尤其是外毛细胞排列紊乱,甚至全部缺失。HPLC检测耳蜗内淋巴液结果显示:灌服一定剂量的枸橼酸西地那非后,能在小鼠耳蜗内淋巴液中检测到枸橼酸西地那非,出峰时间约在5.2min,且给药剂量增加,波峰增高,说明耳蜗内淋巴液中西地那非积聚浓度与给药剂量相关。　　2.应用全细胞式膜片技术分别检测正常组和枸橼酸西地那非低剂量组耳蜗内毛细胞的钙电流和细胞膜电容,所得数据做两样本t检验。结果显示:所检测的钙电流为内向电流,且成电压依赖性的激活。与正常组相比,枸橼酸西地那非使耳蜗内毛细胞钙电流内流减少,(P<0.05,差异有统计学意义),同时该药使内毛细胞的膜电容增量降低(P<0.05,差异有统计学意义)。　　结论:　　1.枸橼酸西地那非可吸收入血液并能够通过血迷路屏障进入内耳,在内耳积聚;服用一定剂量的枸橼酸西地那非可以造成小鼠听力损伤。　　2.枸橼酸西地那非可以造成耳蜗毛细胞的损伤,其损伤程度与使用剂量及时间有关。　　3.枸橼酸西地那非使小鼠耳蜗内毛细胞的电生理发生改变,具体表现为内向钙电流和细胞膜电容减少,这可能是该药导致耳毒性的机制之一。

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第一章 前言

第二章 枸橼酸西地那非对小鼠听力的影响

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 枸橼酸西地那非对小鼠耳蜗内毛细胞钙电流和膜电容的影响

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

3.4 小结

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

研究生期间发表文章

致谢