耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行克隆替代的机制研究

摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)是重要的人类病原菌,除可引起人类皮肤和软组织化脓性感染外,尚可致肺炎、关节炎、骨髓炎、剥脱性皮炎、胃肠炎、脓毒血症、毒性休克综合征等多种疾病,严重危害人类健康。随着抗生素在临床的广泛使用,金葡菌的耐药性不断增强,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的出现及其耐药性的快速增长,目前已成为全球院内获得性感染的首要病原菌,引起全球卫生领域的高度关注。美国2005年因 MRS A感染导致的死亡人数就已经超过乙型肝炎和艾滋病的总和;我国耐药监测网的12家医院2011年向美国JMI实验室提供的2278株医院感染细菌中,金葡菌分离率排第一位(占15.1％,343/2278)。有研究者将MRSA、HBV、HIV称为当前全球三大感染性病原微生物。　　应用金葡菌的分子分型方法,如葡萄球菌染色体盒(staphylococcal cassette chromosome mec, SCCmec)分型,染色体脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析,多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),以及葡萄球菌A蛋白基因分型(staphylococcal protein A gene typing, spa)等,对不同地区的流行分离株进行分析后发现:特定地区的金葡菌感染主要由少数几个优势克隆群(clonal complex, CC)引起。如美国流行的最主要金葡菌克隆群是USA300(CC8),英国等欧洲国家主要是CC22和CC30,而亚洲国家最主要的流行克隆群是ST239。Liu等(2009)对我国14个城市的MRS A菌株进行分析鉴定发现,S T239是我国最主要的MRSA克隆群,占80.8%(567/702)。我们课题组前期对分离自重庆、上海、北京、广州、沈阳、乌鲁木齐等6城市的309株 MRS A进行分子分型研究也发现 ST239占51.5%(159/309)。MRS A的分子流行病学研究还发现:特定地区流行的M RSA菌株克隆群不是恒定不变的,而是存在克隆群相互替代的现象。如在英国,CC22 MRSA克隆群在2001~2007年间逐渐取代了CC30而成为最主要的流行克隆群;在德国,一家医院经过11年的监测研究发现, CC45-MRSA-IV和 CC5/ST228-MRS A-I两个克隆群逐步被 CC22-MRSA-IV和CC5-MRSA-II所取代;在匈牙利,1994年到1998年之间最主要的流行MRS A克隆群为S T239,然而自2001年至2004年间被S T228和 ST5克隆群所取代。我国最主要的 ST239 MRSA克隆群内有2个优势克隆, ST239-MRSA-III-t037和 ST239-MRSA-III-t030。研究发现,2000年之前ST239-MRSA-III-t037为我国流行的第一大MRSA克隆,但2000年之后该克隆的地位被 ST239-MRSA-III-t030克隆取代,这种克隆群之内的克隆替代现象尚未在国际上其它地区发现,开展对其替代机制的研究,不仅对理解我国最主要克隆群内克隆的更替有重要意义,而且可为针对性研发新型抗MRSA感染药物提供重要参考依据。　　MRSA克隆群或克隆的替代机制复杂,菌株本身的特性、抗生素的使用与选择压力、地理因素、人群流动、环境因素、适应性代价(fitness cost)等都可能对特定地区的MRSA克隆的变迁产生影响。在法国,研究者发现庆大霉素敏感的 M RSA克隆(GS-MRSA clone)逐步取代了庆大霉素耐药的克隆(GR-MRSA clone)(Laurent et al.2001),说明MRSA会为对特定抗生素的耐药性付出更多代价。Lee等(2007)研究发现,MRSA携带SCCmec元件的不同对菌株的适应性也有影响,如携带SCCmec I型细菌比SCCmec IV型菌具有更强的葡萄糖代谢能力和相对高的生长速率,这也许是在临床分离株中 SCCmec I型 MRSA菌比 IV型更常见的原因。我国流行的ST239-MRSA-III-t037和ST239-MRSA-III-t030均携带同一种SCCmec,即SCCmec III,那么发生在我国的 ST239-MRSA-III-t030替代 ST239-MRSA-III-t037的机制也许更为复杂。本课题组前期从我国6座城市9所医院的 MRSA分离株中,鉴定出ST239-MRSA-III克隆株159株,其中 ST239-MRSA-III-t030占56.6%(90/159), ST239-MRSA-III-t037占30.2%(48/159)(Cheng et al.2013)。有趣的是,我们也发现大多数 ST239-MRSA-III-t030菌株都对利福平耐药而对复方新诺明敏感,而ST239-MRSA-III-t037菌株都对利福平敏感且大多数对复方新诺明耐药,这一独特的耐药现象是否在我国 M RSA克隆的替代中发挥作用尚不清楚。为探索我国ST239-MRSA-III-t030替代ST239-MRSA-III-t037而成为最主要流行克隆的机制,本研究从重庆、上海、广州三个地区分离的ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037菌株随机抽出24株(每地8株)配成12个t030/t037菌株对,采用生长曲线测定、体外竞争实验、交叉抑制实验,体内竞争实验、耐药性再检测、耐药决定簇分析及相关基因表达水平的检测等方法,深入探讨 ST239-MRSA-III-t030克隆的生存优势以及与耐药性的关系,发现ST239-MRS A-III-t030较ST239-M RSA-III-t037有更强的生存能力,这种生存优势可能与 ST239-MRSA-III-t030菌株普遍存在利福平耐药,而ST239-MRSA-III-t037普遍存在复方新诺明耐药有关。主要研究内容和结果分述如下:　　1. MRSA菌株耐药谱的再测定:前期收集的为各临床实验室的药敏试验结果,为统一标准,采用BHI肉汤稀释法检测了24株MRS A对利奈唑胺,替考拉宁,万古霉素,苯唑西林,克林霉素,利福平,复方新诺明的药物敏感性。结果发现24株菌株均对利奈唑胺,替考拉宁和万古霉素敏感,对苯唑西林耐药,有11株对克林霉素耐药(CQ08除外);12株ST239-MRS A-III-t030菌株都对利福平耐药且均对复方新诺明敏感;相反,12株ST239-MRSA-III-t037菌株都对利福平敏感,其中11株对复方新诺明耐药(SH02除外)。　　2. MRS A菌株的生长曲线测定:采用TSB培养基,体外对12对金葡菌的生长曲线进行检测分析。结果11个M RSA菌株对中ST239-M RSA-III-t030菌株表现出显著较短的生长迟缓期,培养24小时后能够检测到较高的 OD600吸光度值。剩下一组(SH05/SH39)菌株的生长迟缓期虽然相似,但在培养24小时后 ST239-MRSA-III-t030菌株也可以达到更高的 O D600吸光度值。表明在独立生长的情况下, ST239-MRSA-III-t030菌株较ST239-MRSA-III-t037生长更快,在培养24h后能达到更高的生长量。　　3.体外竞争与交叉抑制实验:①将24株细菌的过夜培养物分别稀释至0.5个麦氏浓度,各取100μl按12个菌株对进行1:1混合,接种于新鲜BHI培养基,37℃培养24小时,利用ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRS A-III-t037对抗生素敏感性不同,采用稀释铺板计数法检测混合培养后各克隆的菌落总数,计算t030/t037的比值。结果12对菌株中有9对 ST239-M RSA-III-t030在培养24小时后菌落数目显著高于ST239-MRSA-III-t037,还有1对的t030/t037的比值大于1,但差异不显著,表明多数ST239-MRSA-III-t030菌株在同一环境条件下的竞争中存在优势。②将t030与t037菌株过夜培养上清中的蛋白用三氯醋酸沉淀后进行SDS-PAGE分析,发现两者的分泌蛋白存在很大差异,为证实一种菌分泌的蛋白是否对另一种菌的生长产生了抑制作用,我们用培养t030菌株7h或者4 h的上清去培养t037,同时用培养t037菌株7h或者4 h的上清去培养t030,通过这种交叉抑制实验,结果没有发现MRSA t030与t037菌株之间存在交叉抑制作用,前述 ST239-MRSA-III-t030在体外生存竞争的优势并非由于t030分泌了特定的抑制因子抑制了t037菌株生长而引起。　　4.体内竞争实验:为检测ST239-MRSA-III-t030是否在体内感染中也有竞争优势,随机抽取2个t030/t037菌株对(CQ29/CQ40,SH08/SH02),过夜培养后用PBS制备成1×108CFU/ml的菌液,各取50μl混合成菌株对,每对菌株经小鼠尾静脉感染5只Balb/c小鼠,3天后处死动物,取肾脏,制成悬液,稀释后采用铺板计数法检测每只小鼠肾脏中细菌的感染量。结果发现,两个实验菌株对中 ST239-MRSA-III-t030菌株在小鼠体内每只肾脏中感染量分别达到了每颗肾脏(9.06±0.40)×106CFU和(9.01±0.42)×106CFU,显著高于ST239-MRSA-III-t037菌株感染肾脏的(3.7±0.80)×106CFU和(4.48±0.69)×106CFU,表明 ST239-MRSA-III-t030在小鼠体内也较ST239-MRSA-III-t037有竞争感染优势。　　5.耐药决定簇及相关基因表达水平检测:我国流行的 MRSA克隆ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037在耐药谱上主要表现在对利福平和复方新诺明耐药性的差异,复方新诺明被我国MRS A感染防治专家委员会推荐为M RSA皮肤和软组织感染以及深部根除性治疗的药物,而利福平的穿透力强,专家建议与穿透力弱或副作用较强的药物,如万古霉素等,联合应用于M RSA感染的根除性治疗或手术的感染预防。　　①细菌对利福平的耐药主要发生在 RNA聚合酶β亚单位(RpoB)的基因突变,本研究对12株ST239-MRS A-III-t030的rpo B基因进行了PCR扩增和测序分析。结果显示所有被测菌株都发生了RpoB L466S和H481N的氨基酸替换突变,使得t030菌株的利福平MIC值达到了512μg/ml甚至1024μg/ml。相对而言,复方新诺明通过干扰细菌的叶酸合成途径,抑制细菌的DN A合成而杀菌,MRS A菌对复方新诺明的耐药机制复杂,本研究对12株ST239-MRSA-III-t037菌株中可能与复方新诺明耐药相关的基因,包括胸腺嘧啶核苷合成酶基因thyA;二氢叶酸还原酶基因dfrA;二氢叶酸合成酶基因dhps进行了全基因的PCR扩增和测序分析,结果在这3个基因中没有任何碱基序列的突变,提示我国 MRSA菌对复方新诺明的耐药机制与国外报道的显著不同,需要更多的研究进行探索。　　②细菌发生耐药性突变往往需要付出更高的适应性代价(fitness cost),但MRSA对利福平的耐药性突变,如RpoB H481N会因另一个位点的突变,如S529L,获得适应性补偿(O’Neill et al.2006),而且这种RpoB双突变还会通过上调 MRSA许多基因的表达来增强菌株的适应性,我们随机对2组(CQ29/CQ40, SH50/SH31)菌株培养至对数生长期的 RNAIII基因和α-溶血素基因的表达水平进行荧光定量 RT-PCR检测,结果显示这些基因在 ST239-MRSA-III-t030中的表达显著高于ST239-MRSA-III-t037。虽本研究暂未检测出ST239-MRSA-III-t037菌株耐复方新诺明的基因突变位点,但12株ST239-MRSA-III-t037中有8株在培养基上显示生长受限,表现为小菌落(small colony varients, SCVs)形态,表明ST239-MRSA-III-t037对复方新诺明的耐药需要付出更高的生存代价,这也许是临床上 ST239-MRSA-III-t037逐步被ST239-MRSA-III-t030替代的重要原因。　　综上所述,本研究选择我国重庆、上海和广州三个地区分离的ST239-MRSA-III-t030和ST239-MRSA-III-t037菌株进行配对研究,从耐药谱分析、生长曲线测定、体内外竞争实验、交叉抑制实验、耐药决定簇检测及基因表达分析,发现 ST239-MRSA-III-t030较 ST239-MRSA-III-t037有更强的生存优势,初步阐明了我国 ST239-MRSA-III-t030逐步替代 ST239-MRSA-III-t037而成为最优势克隆的机制,对深入认识MRS A的感染与流行,以及探索控制日益猖獗的MRS A感染新策略均有重要意义。

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缩略语表

英文摘要

中文摘要

第一章 前 言

1. 1选题缘由

1. 2 研究背景

1. 3 研究意义

1. 4 研究内容

1. 5 研究方法

第二章 ST239-MRSA-III-t030/ST239-MRSA-III-t037菌株生存特性研究

2. 1 材料与方法

2. 2 结 果

2. 3 讨 论

第三章 ST239-MRSA-III-t030替代ST239-MRSA-III-t037的机制探讨

3. 1材料和方法

3. 2 结 果

3. 3 讨 论

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

攻读学位期间发表的文章

致谢