有氧胁迫下幽门螺杆菌球形变异相关蛋白的鉴定及功能研究

摘要

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是人类慢性活动性胃炎和消化溃疡的重要原因，与胃癌和胃淋巴样组织淋巴瘤的发生也极度相关。目前人类对其生物学特点、致病机制及其与宿主的关系等方面均尚未完全阐明。随着对Hp在分子水平上的研究不断深入，人们发现Hp较其它细菌表现出更高的生物多样性，提示该菌面对复杂的定居环境，具有高度的变异性和独特的适应性机制。大量研究发现，Hp在各种不利因素的作用下可发生形态变异，由螺旋体转变为球形体。Hp作为一种专性微需氧菌，在有氧胁迫下更容易发生适应性变异，转变为一种有活力但不能培养成活(viablebutnoculturablestage,VNC)的Hp球形变异体，其在Hp感染的传播途径及其相关消化系统疾病的复发中可能发挥着重要作用。研究Hp在有氧胁迫下发生适应性球形变异的变异特征及其变异本质，解析Hp的适应性调节元件，将为揭示Hp可能的传播途径、阐明Hp的适应性变异机制，以及创新性地开展基因工程改造Hp菌株耐氧培养的研究提供有力的实验依据。Hp菌26695株和J99株全基因组测序工作的完成，为后续的蛋白质组学研究提供了条件。近几年，国内外研究者采用蛋白质组学技术相继在Hp的遗传变异、生理、免疫靶点筛选及毒力因子确定等方面进行了一系列的研究，而在有氧胁迫下Hp发生适应性球形变异方面却未见相关研究报道。 本研究选择Hp临床分离株，采用高氧浓度的培养条件，有氧胁迫Hp发生球形变异，建立稳定的球形体模型，进而对Hp球形体的超微结构、菌体代谢、酶活特性、毒力因子mRNA水平表达差异、体内外回复定植力等变异特征进行实验研究。同时，采用目前蛋白质组学研究中的核心技术——双向电泳，对适应性变异前后的Hp螺旋体和球形体进行全菌蛋白质表达谱的比较分析，再通过MALDI-TOF质谱技术对差异蛋白进行初步鉴定分析，最后通过基因克隆技术构建差异蛋白相关基因的Hp高表达菌株，验证该基因在有氧胁迫条件下对Hp氧耐受性的作用。具体研究结果如下： 1.有氧胁迫下Hp球形体的变异特征研究：针对Hp5％的微需氧培养要求，采用与大气氧分压(20％)相一致的高氧浓度培养条件，有氧胁迫Hp发生球形变异，建立稳定的球形体模型，进而对Hp球形体的超微结构、菌体代谢、酶活特性、毒力因子表达差异等变异特征进行实验研究。结果表明，随着有氧胁迫时间的延长，Hp螺旋体逐渐转化为球形体，菌体代谢水平及相关酶活性逐渐下降并趋于稳定；而采用实时荧光定量PCR对Hp定居毒力及抗氧化相关基因进行mRNA水平表达差异比较的结果显示，Hp球形体被检基因的表达水平均较螺旋体有所减少。其中cagA、vacA、hpaA基因的表达降低幅度较大，而ureB、sodB、kat基因的表达降低幅度较小。研究结果提示，Hp球形体在相关酶活性和基因表达水平存在差异，表明该基因编码的蛋白在Hp有氧胁迫条件下的适应性调节机制及维持菌体存活中可能发挥着重要的作用。 2.Hp球形体的回复性实验研究：前述研究结果提示，有氧胁迫下诱导形成的Hp球形体其代谢活性和毒力均有所降低，但并未完全丧失。它脱离了不利环境后也许会重新复苏，回复为可培养增殖的螺杆状Hp而再次致病。本研究在布氏肉汤的基础上设计了几种培养基，同时采用有氧胁迫诱导的Hp球形体感染蒙古沙鼠(Mongoliangerbil)，观察Hp球形体在体内、体外可能发生的回复现象。结果显示，在设计的四种固、液体培养基中，Hp球形体均未能在体外回复生长；而在用Hp球形体感染沙鼠的体内实验中却观察到了球形Hp的回复定植。同时，感染小鼠胃粘膜的Hp定量培养和组织学检测结果显示，Hp螺旋体感染组在小鼠胃内的定植密度较高，且胃粘膜下可见大量炎症细胞浸润；而球形体感染组并未见到小鼠胃粘膜组织的明显炎症损伤，且仅有少量回复的螺旋体定植。本研究证实，Hp球形体作为一种低水平代谢休眠体，代谢活性及毒力虽均有所减弱，但仍具有潜在的致病性；本研究支持至少部分Hp球形体具有活力但体外不能培养成活这一假说，提示“粪-口”传播应引起更多的关注。 3.Hp双向电泳技术体系的建立：为了深入进行Hp的比较蛋白质组学研究，本课题通过比较以冻融和超声为基础兼加化学活性剂的Hp菌体蛋白提取方法，旨在建立稳定、有效的Hp蛋白质组双向电泳技术体系。结果表明，取1mg经冻触兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10一步法提取的Hp菌体蛋白，双向电泳图谱经分析显示，有521±36个蛋白斑点，但有“晕轮”效应和“纹理”效应；而分别取1mg和2mg经超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10一步法提取的Hp菌体蛋白，分析显示分别有603±12个和638±29个蛋白斑点，且蛋白斑点明显，界限清晰。结果证实超声兼化学活性剂法是有效裂解细菌并高效提取菌体蛋白的方法。 4.Hp球形变异相关蛋白的筛选与鉴定：在建立了稳定、高效Hp蛋白质组双向电泳技术体系的基础上，本研究采用微需氧培养的典型HP螺旋体和有氧胁迫下形成的Hp球形体进行全菌蛋白质表达谱的比较蛋白质组学研究。双向电泳图谱经PDQuest6.0软件分析，两者的总蛋白分布模式基本相似，电泳图谱的平均相关系数为0.67。CBB染色可分别检出635±18和614±27个蛋白点。选择差异最明显，点光密度值较大的10个蛋白点，用MALDI-TOF-MS进行肽质量指纹图谱分析和数据库查询，结果成功鉴定出7个差异蛋白。其中翻译延长因子Tu(EF-Tu)、尿素酶G(UreG)、丙酮酸-黄素蛋白氧化还原酶(POR)、超氧化物歧化酶(SOD)、热休克蛋白10(Hsp10)的表达量在Hp球形体中显著升高；而黄素氧化还原蛋白(Fld)、烷基化氢化氧化酶(Ahp)则在Hp螺旋体中高表达。经文献检索证实，EF-Tu是与转录和翻译相关的蛋白，其在Hp球形体中的表达量增高，说明球形体的蛋白质翻译过程并未停止。POR和Fld是与能量代谢相关的蛋白，它们在Hp中的差异表达，表明Hp球形体作为一种低水平代谢休眠体，其能量代谢并未停止。而UreG和Hsp10作为尿素酶合成的辅助蛋白和分子伴侣，在Hp球形体中的高表达，可能在维持Hp球形体的尿素酶活性和稳定性中发挥着重要作用。同时研究证实，SOD作为生物体防御氧化损伤的重要金属酶系之一，能特异清除生物体在有氧代谢过程中产生的活性氧自由基(O-2)。其在Hp球形体中的高表达提示，SOD可能作为Hp在有氧胁迫条件下的一种适应性调节蛋白，在清除ROS、维持机体氧化与抗氧化平衡、保持菌体存活中起着至关重要的作用。 5.sodB基因在Hp中的高表达及其对Hp氧耐受性影响的实验研究：本研究首先以HpM13菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增HpsodB基因序列，将其克隆到含GFP的质粒pAcGFP中，构建了pAc-sodB-GFP示踪表达载体。再以重组质粒pAc-sodB-GFP为模板，通过PCR扩增sodB-gfp融合基因及其前端的Lac启动序列，将其克隆到含有HppHell复制子的质粒pMuH36中，获得重组表达质粒pMuH36-sodB-GFP，将其电转化HpM13菌株，重组菌命名为HpPSG。通过SDS-PAGE、Westernblotting、荧光显微镜观察、SOD表达活性的检测，证实sodB基因在重组菌HpPSG中高表达。 同时，重组菌HpPSG在不同氧分压条件下对氧耐受性的实验研究结果发现，在10％氧分压气体环境下，HpPSG在诱导后即SOD高表达后其生长曲线与HpM13未转化菌存在较明显差异(0.05＞P＞0.01)。HpM13未转化菌在培养至64h左右其球形体形成率已接近80％；而HpPSG在同样条件下其活菌浓度仍保持稳定，镜下观察菌体形态典型，直至56h才见有少量球形体形成。其球形体形成时间及形成率与HpM13未转化菌相比较，也存在较明显差异(0.05＞P＞0.01)。结果表明，SOD在重组菌HpPSG中的高表达，在高于微需氧(5％)一定限度的氧分压(10％)气体培养环境下，提高了Hp对氧的耐受性，一定程度上延缓了球形体的形成，促进了Hp在有氧胁迫条件下的耐氧生长。该研究结果不仅进一步确定了SOD在Hp氧化应激条件下的适应性调节作用，同时也为开展基因工程改造Hp菌株耐氧高密度培养的研究奠定了坚实的实验基础。

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英文缩略表

摘要

前言

第一部分有氧胁迫幽门螺杆菌球形变异的实验研究

第二部分有氧胁迫幽门螺杆菌球形变异前后的比较蛋白质组学研究

第三部分sodB基因在Hp中的克隆表达及其对Hp氧耐受性影响的实验研究

全文总结

致谢

参考文献

附图

文献综述一幽门螺杆菌球形体的研究进展

文献综述二幽门螺杆菌代谢组学研究进展

攻读学位期间发表的学术论著目录