骨形成蛋白-4在大脑皮质发育障碍中的作用及机制研究

摘要

大脑皮质发育障碍(Malformations of corticAldevelopment, MCD)是药物难治性癫痫的重要病因。随着影像技术的发展，在癫痫患者中，MCD的临床确诊率不断提高。　　 现已证实约有40％的药物难治性癫痫是由MCD 所致，而在小于3岁的儿童药物难治性癫痫患者中MCD 所占比例更高达80％。抗癫痫药物治疗效果不佳，目前外科手术切除癫痫灶是治疗MCD的有效手段之一。　　 MCD是一类病理学表现类似疾病的总称，主要包括结节性硬化(tuberous sclerosiscomplex, TSC)、局灶性大脑皮质发育不良(focAlcorticAldysplasia, FCD)、多小脑回、无脑回畸形及Sturge-Weber 综合征等亚型，其中TSC和FCD是最常见的MCD 亚型。　　 FCD表现为局灶性大脑皮质发育畸形。最新的临床病理研究显示，FCD 已经成为我国药物难治性癫痫的首要病因(52.9％)。FCD 典型的组织病理学表现包括大脑皮层层状结构和柱状结构紊乱、脑回结构破坏，出现大量异形神经元(dysmorphic neurons, DNs)、巨形神经元(giant neurons, GNs)以及气球样细胞(balloon cells, BCs)等，这些异常的细胞被称作异构神经元(malformed neurons, MNs)。而在MCD 另一种常见亚型TSC中，皮质结节是其脑损害最典型的病理性标志，具有典型的MCD 病理特征，表现病灶内皮质板层结构破坏消失，并伴有异构神经元，如DNs 以及巨细胞(giant cells, GCs)。临床资料研究表明伴有MNs的MCD患者更易出现癫痫发作。因此，MNs在MCD的致痫灶中可能发挥致痫作用。目前对于MCD及MNs 病理发生机制所知有限，对涉及其中的关键因子、信号途径仍待阐明。　　 骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是转化生长因子(transforminggrowth factor, TGF)超家族的成员之一，最早发现其在骨骼系统的发育形成中发挥重要作用，随后越来越多的研究表明，BMP信号通路同样密切参与中枢神经系统(centralnervous system,CNS)前体细胞的发育及成熟过程。BMP 包括7种亚型，其中BMP-2/-4在神经系统中的作用得到广泛共识。BMP-4通过两类胞膜受体发挥作用，即I 型受体(BMPRIa和BMPRIb)和Ⅱ型受体(BMPRⅡ)。BMP-4蛋白首先与Ⅱ型受体结合，再招募I型受体并使之磷酸化，进而将胞外信号转导入细胞内。　　 BMP信号通路在神经系统发育期和成年期均具有重要的作用。在神经系统发育期，BMP信号促进背侧神经管发育，调节细胞增殖及决定神经前体细胞的分化。在成年期，BMP信号在CNS 持续表达，作用于神经前体细胞的增殖和分化。除此之外，大量研究证实，BMP信号通路在神经系统疾病病理中同样发挥重要的作用。我们先前的研究发现，戊四氮点燃的癫痫模型鼠中，海马齿状回BMP-4表达升高，促进癫痫发作后海马神经元的增殖，有力提示了BMP-4与癫痫的发作密切相关。　　 那么BMP-4及其受体在MCD中的表达模式如何？是否参与MCD及MNs的病理发生和维持机制？　　 为证实上述设想，本研究首先采用RT-PCR、Western-blot、免疫组织化学及免疫荧光双标法观察了BMP-4及其受体(bone morphogenetic protein receptors, BMPRs)(包括：BMPRIA, BMPRIB和BMPRII)在MCD和正常对照皮层(control cortex, CTX)中的表达及细胞定位；其次，构建了宫内照射的MCD大鼠模型，采用免疫荧光双标法测定BMP-4的表达及细胞定位；最后，观察了与BMP-4 高度同源的BMP-2在MCD 临床标本和CTX中的表达变化。通过上述研究，得到如下结果：　　 一． BMP-4在MCD 临床标本中的表达及细胞定位1.通过RT-PCR和Western-blot，从基因和蛋白水平证实，CTX表达BMP-4；免疫组化结果显示，BMP-4在CTX中广泛表达于神经元和胶质细胞。　　 2.在FCD中，我们发现BMP-4的mRNA及蛋白水平较CTX表达明显减低。免疫组化结果显示，BMP-4在FCD 皮层显示出异常的表达模式：强表达于GNs、DNs和反应性星形胶质细胞，中度或强表达于BCs，而在形态正常的神经元上表达减弱。　　 免疫荧光双标结果显示：BMP-4 阳性的MNs与神经元的标志物NeuN，NF-200和MAP-2 共定位，但不与星形胶质细胞标志物GFAP 共表达，GFAP 阳性的反应性星形胶质细胞表达BMP-4。　　 3.在TSC 结节中，BMP-4的mRNA及蛋白水平较CTX表达减低。免疫组化结果显示，BMP-4在TSC中的细胞表达定位与FCD中的表达定位相似：BMP-4 强表达于DNs，中度或强表达于GCs，而在形态正常的神经元上表达减弱。免疫荧光双标结果显示，BMP-4 阳性的MNs与神经元的标志物NeuN，MAP-2和NF-200共表达，但不与GFAP 共定位。GFAP 阳性的反应性星形胶质细胞表达BMP-4。　　 二． BMP-4 受体BMPRs在MCD中的表达及分布1. 利用Western-blot分析，我们发现BMPRs(BMPRIA，BMPRIB和BMPRⅡ)在MCD中的蛋白表达水平较CTX 均明显减低。　　 2.免疫组化结果显示，BMPRIA，BMPRIB和BMPRⅡ具有相似的表达的模式。在FCD中，BMPRs 强表达于MNs和反应性星形胶质细胞，而在形态正常的神经元上表达减弱；免疫荧光双标结果显示：○1BMPRs 阳性的MNs与神经元标志物NeuN，MAP-2和NF-200共定位；○2 BMPRIA和BMPRIB 阳性的MNs 可与星形胶质细胞标志物GFAP 共表达，表明MNs 异常复杂的细胞表型；有趣的是我们未观察到BMPRⅡ阳性MNs与GFAP 共标记；○3 GFAP 阳性的反应性星形胶质细胞表达BMPRs。　　 在TSC 结节中，BMPRs 强表达于MNs和反应性星形胶质细胞上，而在形态正常的神经元上表达减弱。免疫荧光双标结果显示：○1BMPRs 阳性的MNs与神经元标志物NeuN，MAP-2和NF-200共表达；○2 BMPRIA和BMPRIB 阳性的MNs 可与GFAP共表达；但未观察到BMPRⅡ阳性的MNs与GFAP 共表达；○3 GFAP 阳性的反应性星形胶质细胞和CD-68 阳性的小胶质细胞(或巨噬细胞样细胞)均表达BMPRs。　　 三． BMP-4在MCD大鼠模型中的表达分布○1建立宫内照射的MCD大鼠模型。○2通过HE和尼氏染色，在P1，P5，P10和P30期，分别观察了MCD 模型大鼠大脑皮层的结构改变。○3免疫荧光双标发现BMP-4在MCD 模型鼠中表达增高，主要表达于MNs、反应性星型胶质细胞以及形态正常的神经元。　　 四． BMP-2在MCD中的表达分布1. 利用Western-blot分析，我们发现BMP-2在CTX 存在表达。免疫组化结果显示，BMP-2在CTX 广泛表达于神经元和胶质细胞。　　 2.Western-blot 结果显示，BMP-2在MCD中的表达较CTX 明显减低。免疫组化结果显示，在FCD和TSC中，BMP-2 显示出相似的表达模式，强表达于MNs和反应性星形胶质细胞，而在形态正常的神经元上表达减弱。　　 本研究中，我们通过RT-PCR和Western-blot 证实BMP-2/-4及其受体(BMPRIA,BMPRIB和BMPRII)在MCD中的表达较CTX 明显减低。BMP-2/-4及其受体主要表达于异构神经元和反应性星形胶质细胞，而在形态正常的神经元上表达减弱。此外，在MCD大鼠模型中，我们发现BMP-4表达升高，主要定位于异构神经元和星形胶质细胞。总之，上述研究结果提示，BMP-2/-4信号系统与MCD的发生机制密切相关，可能作用于MNs的病理发生，反应性胶质增生以及皮质的异常发育。

目录

文摘

英文文摘

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声明

前 言

第一节 BMP-4 在MCD 中的表达及细胞定位

第二节 BMP-4 在MCD 大鼠模型中的表达分布

第三节 BMP-2 在MCD 中的表达分布

全文总结

致 谢

图 片

文献综述

学习期间发表和待发表的论文