声明
主要符号对照表
第一章 绪论
1.1 A型流感病毒概述
1.2 流感大流行
1.3 A型流感病毒结构
1.3.1 病毒核糖蛋白复合物
1.3.2 病毒的基质蛋白
1.3.3 病毒的表面蛋白
1.3.4 非结构蛋白
1.4 A型流感病毒的复制周期
1.4.1 病毒的吸附和脱壳
1.4.2 病毒核酸的复制和翻译
1.4.3 病毒的包装和出芽
1.5 M2蛋白与细胞自噬的关系
1.6 研究目的及意义
第二章 A型流感病毒M2蛋白LIR结构域疏水性氨基酸对病毒的影响
2.1 实验材料
2.1.1 细胞、菌株与质粒载体
2.1.2 主要使用仪器设备
2.1.3 主要使用酶与其他试剂
2.1.4 实验动物
2.1.5 常用试剂和培养基的配制
2.1.6 本章节引物设计
2.1.7 分析统计软件的使用
2.2 两种LIR结构域突变的M2蛋白反向遗传质粒的构建
2.2.1 通过PCR构建多点突变质粒
2.2.2 片段的电泳与回收
2.2.3 质粒转化、阳性菌大量繁殖和质粒提取
2.3 突变型流感病毒的拯救
2.3.1 病毒的反向遗传拯救
2.3.2 SPF鸡胚扩增病毒
2.3.3 病毒鉴定
2.3.4 拯救病毒的滴度测定
2.4 三种病毒的浓缩与纯化
2.5 突变病毒与野生型病毒粒子的的形态与囊膜完整性
2.5.1 胰酶消化实验
2.5.2 电子显微镜观察病毒粒子
2.6 突变病毒与野生型病毒的致病力的差异
2.6.1 呼吸道病毒接种
2.6.2 体重检测以及症状观察
2.6.3 攻毒小鼠的肺脏病变观察以及脏器病毒滴度的滴定
2.7 突变病毒与野生型病毒的生长复制差异
2.8 结果
2.8.1 WSN-WT、WSN-M2/AAA、WSN-M2/SSS突变型病毒的拯救和鉴定
2.8.2 三组病毒的滴度滴定
2.8.3 三种病毒粒子的囊膜完整性和粒子形态
2.8.4 攻毒实验的小鼠体重曲线与存活率
2.8.5 攻毒实验的小鼠肺脏滴度差异
2.8.6 攻毒实验的小鼠脏器病理变化
2.8.7 三种病毒的生长曲线
2.9 本章小结与讨论
第三章 LC3蛋白敲除的A549细胞系的构建与对A型流感病毒感染的影响
3.1 实验材料
3.1.1 毒株、细胞、菌株与质粒载体
3.1.2 主要使用仪器设备
3.1.3 主要使用酶与其他试剂
3.1.4 常用试剂和培养基的配制
3.1.5 生物学数据分析软件
3.1.6 sgRNA引物设计
3.2 LC3蛋白敲除A549细胞系的构建
3.2.1 sgRNA的寡核苷酸的磷酸化以及退火
3.2.2 lentiCRISPRv2载体的酶切
3.2.3 sgRNA与LentiCRISPRv2载体的连接
3.2.4 连接产物转化与阳性质粒的扩增培养
3.2.5 慢病毒包装
3.2.6 慢病毒感染A549细胞系以及嘌呤霉素压力筛选
3.2.7 稳定传代LC3-敲除细胞种LC3蛋白鉴定
3.3 LC3蛋白敲除A549细胞系细胞活性
3.4 A型流感病毒在LC3敲除A549细胞中生长复制以及病毒形态
3.4.1 不同细胞系中A型流感病毒的复制能力差异
3.4.2 不同时间点病毒滴度滴定
3.4.3 在两种细胞上进行流感病毒的扩增和纯化
3.4.4 两种细胞系中扩增的子代病毒粒子对胰酶耐受能力检测
3.4.5 两种细胞系中扩增的子代病毒粒子的囊膜和形态观察
3.5 结果
3.5.1 获得嘌呤霉素抗性的阳性细胞中LC3蛋白含量的鉴定
3.5.2 A549-LC3KO细胞形态
3.5.3 A549细胞系与A549-LC3KO细胞系细胞活性差异
3.5.4 H1N1病毒在两种不同细胞系中生长复制能力的差异
3.5.5 不同细胞系中扩增子代病毒粒子对胰酶耐受性
3.5.6 不同细胞系中扩增子代病毒粒子形态差异
3.6 章节小结与讨论
第四章 全文结论
参考文献
致 谢
作者简历
中国农业科学院;
