基于SNP和SSR标记的牛肉产品溯源鉴定技术研究与应用

摘要

可追溯在保证食品质量安全，保护消费者合法权益等方面具有重要作用，然而目前的耳标和标签系统无法确保从动物饲养—屠宰—加工—销售各环节追溯信息的真实性。而DNA溯源技术因其稳定及不可更改的特性，为实现“物码合一”的验证及溯源链条的无缝链接提供了新的技术手段。因此，本研究开展了基于SNP和SSR标记的牛肉产品溯源鉴定技术研究，为今后DNA溯源技术的推广应奠定基础。主要内容及研究结果如下:　　1.同步收集DNA样本的动物耳标研制。荧光定量PCR方法考察滤纸等收集载体对血斑样本保存的稳定性，优选了Whatman903＃样本收集纸作为最终样本收集载体。采用12.5丝的热裱膜对收集载体进行热封保护后固定于经改造的动物耳标公订柱上。该耳标实现了动物个体信息记录及DNA样本采集的双重功能，为溯源样本库的建立提供便利。　　2.用于牛肉及产品溯源应用的SNP标记筛选。根据NCBI dbSNP数据库，以市场上常见的7个品种共计176个个体作为测试样本，采用二代测序技术对初选的59个位点进行多态性分析，获得了MAF大于0.3的位点36个，12个多态性最高的位点组合可实现两个随机个体的误判概率不高于百万分之三。通过性状基因进行位点筛选，以市场上最常见的4个肉牛品种共计16个样本为测试样本，PCR扩增基因相关片段后进行Sanger测序，获得多态性位点61个，位点用于溯源应用的区分效果需根据应用群体进一步验证。　　3.两种简便的SNP分型检测方法建立。基于AS-PCR-CE的高通量的分型检测方法，设计等位基因特异性PCR引物，扩增模板后经毛细管电泳分离，根据条带的“有”/“无”判定基因型，该方法的灵敏度为0.4ng/μL。基于胶体金—RPA的快速可视化的分型检测方法，设计RPA引物，利用链霉亲和素—生物素系统对扩增产物进行检测，通过试纸条T、C线来判定样本基因型，该方法的灵敏度为14ng/μL。　　4.SNP标记用于牛肉产品的溯源应用研究。分别采集来源于具有完善产品追溯系统及只具有记录系统的两家肉牛养殖加工企业的样本，利用来源于性状基因的多态性较高的12个SNP位点组合进行基因分型测定，通过肉样及血液样本的12位基因型条码比对实现对企业溯源系统记录真实性及样本来源个体的准确判定。　　5.SNP标记用于牦牛肉与普通牛肉的鉴定研究。根据性状相关基因挑选了等位基因频率在普通肉牛群体中为0.546-0.833、在牦牛群体中为0.009-0.075的10个SNP位点，样本经PCR扩增，毛细管电泳分离后，根据出峰数目进行肉源判定。牦牛肉样本出峰数目在1-3个之间，普通牛肉样本出峰数目在5-10之间，该方法灵敏度为0.3ng/μL。　　6.SSR标记用于牛肉产品的溯源应用研究。以市场上常见的6个品种的共计100个个体作为测试样本，通过荧光多重PCR及毛细管电泳对候选的16个标记位点进行多态性分析，6个多态性最高的位点组合可实现两个随机个体的误判概率不超过百万分之二，与数据库获得的12个SNP位点的区分效果相当。PLS-DA分析表明，该16个位点可以很好地将受试的6个品种区分开。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1．1 研究背景及意义

1．2 肉类食品溯源方法

1．2．1 标签技术

1．2．2 同位素及矿物质元素产地识别技术

1．2．3 DNA溯源技术

1．3 SNP分型检测方法

1．3．1 测序法

1．3．2 基于酶学的检测方法

1．3．3 基于杂交原理的检测方法

1．3．4 基于色谱质谱技术的检测方法

1．4 研究目的及研究内容

1．4．1 研究目的及意义

1．4．2 研究内容

第二章 同步收集DNA样本的动物耳标研制

2．1 材料与试剂

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 收集载体筛选

2．2．2 收集载体保护

2．2．3 耳标公订改造

2．2．4 采样装置组装

2．3 结果与分析

2．3．1 收集载体的确定

2．3．2 收集载体的保护

2．3．3 采样装置的组装

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 SNP标记的筛选

3．1 材料与试剂

3．1．1 材料

3．1．2 试剂

3．1．3 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 样本DNA提取及质量控制

3．2．2 基于数据库位点的筛选

3．2．3 基于性状基因位点的筛选

3．3 结果与分析

3．3．1 DNA提取及质量验证

3．3．2 数据库位点筛选结果分析

3．3．3 性状基因位点筛选结果分析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 SNP分型检测方法建立

4．1 材料与试剂

4．1．1 材料

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．2 胶体金-RPA分型方法建立

4．3 结果与分析

4．3．1 AS-PCR-CE方法验证

4．3．2 胶体金-RPA方法建立

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 基于SNP标记的牛肉产品溯源应用研究

5．1 材料与试剂

5．1．1 材料

5．1．2 试剂

5．1．3 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 样本采集

5．2．2 基因组DNA提取

5．2．3 候选SNP位点及AS-PCR引物筛选

5．2．5 样本分型测定

5．2．6 溯源准确性检验

5．3 结果与分析

5．3．2 溯源应用SNP位点确定

5．3．3 溯源准确性检验

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 基于SNP标记的牦牛肉与普通牛肉的鉴定研究

6．1 材料与试剂

6．1．1 材料

6．1．2 试剂

6．1．3 仪器与设备

6．2 实验方法

6．2．1 样本采集

6．2．3 SNP标记筛选及引物设计

6．2．4 PCR扩增及毛细管电泳分离

6．2．5 实际样本验证

6．3 结果与分析

6．3．1 SNP位点及引物

6．3．2 PCR扩增及毛细管电泳分离

6．3．3 样本等位基因频率分析

6．3．4 实际样本测定结果

6．4 讨论

6．5 小结

第七章 基于SSR标记的牛肉产品溯源应用研究

7．1 材料与试剂

7．1．1 材料

7．1．2 试剂

7．1．3 仪器与设备

7．2 实验方法

7．2．1 样本采集及DNA提取

7．2．2 SSR标记位点的筛选

7．2．3 样本分型测定

7．2．4 位点多态性数据分析

7．3 结果与分析

7．3．1 SSR位点分型测定

7．3．2 SSR位点多态性分析

7．3．3 位点鉴定效果评估

7．3．4 溯源效果验证

7．4 讨论

7．5 小结

第八章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历