CHD2调控大脑皮层发育过程中神经前体细胞的增殖与分化

摘要

在真核生物中，染色质动力学研究在生物学尤其是在发育生物学备受人们关注。研究发现大部分ATP依赖的染色质重塑复合物通过结合广谱表达的基因启动子或者特异性基因的启动子从而调控染色质的动力学变化，进而调控真核生物基因表达。
　　CHD家族蛋白（染色质解旋酶DNA结合蛋白）是一类含有染色质结构域(chromodomains，chromatin organization modifier)、SNF2相关解旋酶/ATP酶结构域以及特异性DNA结合结构域的蛋白质，主要参与染色质结构的重塑和基因转录调控。CHD2属于CHD亚家族Ⅰ，参与哺乳动物发育，肿瘤抑制，DNA损伤修复。相关研究表明CHD2与癫痫性脑病、生长迟缓、脊椎弯曲、智障相关。
　　在大脑皮层发育过程中，神经前体细胞(neural progenitor cells，NPCs)分化产生各种类型的神经元和胶质细胞，从而形成神经系统。尽管CHD2属于ATP依赖的染色质重塑复合物，但其大脑皮层发育中的作用仍不清楚。我们首先发现内源性的CHD2在神经干细胞里特异性表达，因此CHD2可能参与调控神经干细胞(NSCs)的自我更新。通过体外敲降实验证实，敲降CHD2之后，促进所分离的原代神经干细胞的神经元分化同时抑制其自我更新。此外，我们首次采用胚胎电转技术(in utero electroporation)进行体内研究CHD2在大脑皮层发育过程中的作用。在E13.5d的神经前体细胞中特异性敲降和过表达CHD2，表明CHD2参与调控神经前体细胞的增殖。在CHD2敲降后，位于VZ/SVZ(ventricularzone/subvertricularzone)的GFP标记细胞显著减少。通过Brdu标记实验进一步证实，CHD2促进VZ/SVZ的神经前体细胞的S期细胞数目增加。CHD2敲降后VZ/SVZ的神经前体细胞的S期细胞数目减少。过表达CHD2之后，位于VZ/SVZ区的GFP标记细胞显著增加且VZ/SVZ的神经前体细胞S期细胞数目增加。最后，我们通过ChIP实验（chromatin immunoprecipitation）证实CHD2通过结合REST(RE1-silencing transcription factor)的启动子直接调控REST的转录，从而调控神经前体细胞的增殖与分化。此外，CHD2结合启动子区下游的CDS区，可能通过其他机制来调控神经前体细胞的多能性。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 ATP依赖的染色质重塑体

1．2 CHD家族结构域

1．2．1 CHD家族亚族分类及功能

1．2．2 CHD2的功能

1．2．3 神经元产生机制

1．3 研究目的意义

第二章 材料方法

2．1 材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 实验动物

2．1．3 质粒

2．2 实验试剂和仪器设备

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验试剂、培养基的配制

2．2．3 其他常用试剂的配制

2．2．4 主要抗体

2．2．5 主要实验仪器和材料

2．3 实验方法步骤

2．3．1 质粒提取

2．3．2 大肠杆菌感受态的制备

2．3．3 转化

2．3．4 293FT、N2A细胞复苏

2．3．5 293FT、N2A细胞冻存

2．3．6 293FT或N2A细胞培养

2．3．7 E12．5的胚胎大脑皮层NSC细胞分离与培养

2．3．8 DNA琼脂糖凝胶回收

2．3．9 Trizol法提取鼠脑组织总mRNA

2．3．10 CHD2基因目的片段的获得

2．3．11 菌落PCR反应

2．3．12 二步法RT-PCR操作

2．3．13 载体双酶切反应

2．3．14 反转录反应(采用天根Quant cDNA第一链合成试剂盒)

2．3．15 细胞免疫组化染色(immunohistochemical staining)

2．3．16 蛋白质印迹实验(western blot)

2．3．17 胚胎脑组织固定、脱水

2．3．18 冰冻切片

2．3．19 胚胎电转

2．3．20 Brdu标记

2．3．21 慢病毒的包装

2．3．22 病毒滴度的测定

2．3．23 病毒感染细胞

2．3．24 脑片Brdu染色

2．3．25 shRNA质粒的构建

第三章 结果

3．1 构建CHD2敲降质粒

3．2 构建CHD2过表达质粒

3．3 包装病毒及病毒滴度的测定

3．4 Western blotting检测CHD2-shRNA的敲降效率

3．5 RT-PCR检测CHD2过表达效率

3．6 内源性CHD2在神经干细胞／前体细胞的表达

3．7 体外敲降CHD2抑制神经干细胞增殖并促进神经元分化

3．8 利用胚胎电转技术研究CHD2在胚胎脑发育中的作用

3．9 体内敲降CHD2促进神经元分化

3．10 体内敲降CHD2抑制神经干细胞／前体细胞的增殖

3．11 体内过表达CHD2促进神经前体细胞增殖

3．12 CHD2结合REST启动子区调控REST，促进神经前体细胞增殖

第四章 讨论

4．1 CHD2维持神经前体细胞的自我更新

4．2 CHD2结合到REST的启动子上直接调控REST的转录

4．3 尚需解决的问题

第五章 结论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文