一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法

摘要

本发明提供了一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法。首先将间充质干细胞包埋在氯化钙溶液条件下制备的、含有明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中，之后添加神经诱导分化培养液，并在旋转式反应器中进行培养，以促进间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化，并实现其增殖，分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，收获分化细胞。本发明操作简单，成本低，明胶微球可为支架内部细胞提供必要的生长空间，硫酸软骨素可模拟神经组织细胞外基质的生化功能，而海藻酸钙微胶珠提供了近似细胞外基质的三维结构支撑，旋转式反应器则提供了必要的微重力环境，进一步强化传质，并实现其增殖。

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学领域，是一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法。

背景技术

神经前体细胞由于能够分化为神经元，因此是修复神经组织损伤的理想种子细胞。但是人源神经前体细胞来源非常困难，限制了其临床应用。研究已经表明人间充质干细胞可以分化为神经前体细胞，这为神经组织修复提供了新的途径。然而，目前诱导间充质干细胞向神经前体细胞定向分化是在二维条件下进行的。研究已经发现，二维培养条件和体内组织三维生长微环境相差巨大，二维培养的细胞逐渐丢失了其生理功能，这造成使用目前的二维诱导方法定向分化的效率低，且扩增倍数也低。因此，需要迫切发展能够模拟体内神经组织三维微环境的诱导间充质干细胞向神经前体细胞定向分化，并实现前体细胞大量增殖的新方法。

在体内神经组织中神经细胞呈三维状态生长，细胞外基质所形成的三维网络为细胞提供了必要的结构支撑和功能调控。海藻酸钠是一种海洋天然高分子多糖，无毒，生物相容性好，其与钙离子反应能够形成三维水凝胶，此凝胶结构类似神经组织细胞外基质三维网络，因此以其作为框架所构筑的三维诱导体系将最为接近体内神经组织。另外，常规100mM氯化钙条件下制备的海藻酸钙微胶珠内部径向孔道很小，因此物质传递是限制神经分化的一个重要因素，提高钙离子浓度将显著提高其和海藻酸钠分子的反应速度，将形成尺寸更大的朝向中心的径向孔道，从而显著促进因子及营养物质向支架内部传递，有助于进一步提高分化效果和支持细胞扩增。精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)及酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)是神经组织细胞外基质蛋白的活性功能片段，对于神经分化具有显著的促进作用，使用这些多肽修饰后的三维支架将大大加强其诱导分化能力。此外，体内神经组织细胞外基质中还含有大量的硫酸软骨素，它对于神经细胞的存活以及功能发挥起到至关重要的调控作用，将其与三维支架结合在一起将能够同时从物理结构及生化特性上模拟神经组织细胞外基质。另外，细胞的运动以及增殖需要足够的空间，水凝胶的孔隙率一般只有十几微米，大大限制了分化后神经前体细胞的扩增，因此必须增加水凝胶内部的孔隙率或者空间才能实现细胞大量增殖。明胶是胶原水解的产物，具有低温形成凝胶，超过37℃左右变成溶液的特殊性质。将其在低温条件下制备成微球，之后添加到三维支架中，当放置在培养箱中时，支架内部的明胶微球随温度升高将会溶解，在支架内部形成球形空洞，这大大增加了细胞扩增所需要的空间。此外，间充质干细胞向神经前体细胞定向分化需要bFGF和EGF的支持，在体外这两种因子加到培养液中很快就失活，而在含有硫酸软骨素和明胶的体系中，因子和多糖会形成复合结构，显著延缓了因子的降解，进一步提高了因子的支持作用。神经前体细胞是以细胞球的方式生长，旋转式反应器特殊的微重力环境可以使得细胞高效成球，并进一步提高支架的传质效率，从而促进神经分化及扩增。

由以上分析可知，影响神经分化的因素很多，将海藻酸钙凝胶、钙制备条件、硫酸软骨素、明胶微球及旋转反应器有机组合起来，在bFGF和EGF的作用下才能够高效模拟体内神经组织微环境，促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化，并实现其大量增殖。另外，其中涉及到的一些重要参数，包括氯化钙溶液浓度、硫酸软骨素和海藻酸钠混合的质量比、硫酸软骨素分子量、RGD、IKVAV及YIGSR多肽种类和混合比例等将对神经分化及扩增效果有显著性影响。因此，如何设计新型的诱导分化体系及获得最优的参数是急需要解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

首先将间充质干细胞包埋在氯化钙溶液条件下制备的、含有明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中，之后添加神经诱导分化培养液，并在旋转式反应器中进行培养，以促进间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化，并实现其增殖，在分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，收获分化细胞。

所述间充质干细胞包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织来源的间充质干细胞中的一种。

所述含有干细胞、明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠为首先由海藻酸钠溶液和硫酸软骨素溶液以及生理盐水混合，之后将混合液与干细胞及明胶微球混合均匀，并滴加到氯化钙溶液中进行钙化反应制备得到的；

其中，所述的海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比为2.3-6：1、海藻酸钠/硫酸软骨素/生理盐水混合溶液和明胶微球的体积比为5-15：1。

所述间充质干细胞在海藻酸钠溶液与硫酸软骨素溶液和生理盐水混合液中的起始包埋密度为4×10⁶-1×10⁷cells/mL。

所述明胶微球是将10％(W/V)(单位为g/mL)酸性明胶溶液滴加到无菌油酸乙酯或大豆油中，经过1000rmp搅拌10min，使用冰水浴冷却10min，并PBS清洗去除油相得到的；

所述明胶微球直径为100-200μm。

所述硫酸软骨素的分子量为30-40kDa；

所述硫酸软骨素溶液浓度为10％(W/V)单位为g/mL。

所述海藻酸钠的分子量范围为400-800kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)为0.3-2；

所述海藻酸钠为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰海藻酸钠，异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)修饰海藻酸钠，酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)修饰海藻酸钠质量比为1:1:1的混合海藻酸钠；

所述海藻酸钠在海藻酸钠与硫酸软骨素以及生理盐水混合液中的终浓度为2％(W/V)单位为g/mL。

所述神经诱导分化培养液为含有1％N2、20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF的DMEM/F12培养液。

所述氯化钙溶液的浓度为200-300mM。

所述的含有明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠的直径为1-2mm。

本发明具有如下优点：

1.操作简单，成本低。本发明在旋转式反应器中利用含有明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠及神经诱导分化培养液实现诱导间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化，并实现其增殖。方法简单，避免使用昂贵材料和工艺；

2.高效模拟体内神经组织微环境，分化及扩增效果好。三维海藻酸钙微胶珠为细胞提供近似体内细胞外基质的三维框架；活性多肽及硫酸软骨素的添加提高了支架的生化活性，进一步模拟了细胞外基质成分；高钙制备条件及明胶微球为细胞提供了大量的生长空间，并提高了水凝胶的传质速率；明胶及硫酸软骨素降低了bFGF和EGF的降解，充分发挥了其对神经分化的促进作用；旋转反应器则提供了微重力环境，促进神经前体细胞成团和增殖，显著提高体系传质速率。因此，本发明高效模拟体内神经组织微环境，能够进一步提高干细胞神经分化效率和分化细胞的扩增；

3.高活性收集分化后的细胞。在分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，通过离心可在生理条件下收集分化后的细胞，细胞活性高，功能不受影响；

附图说明

图1为本发明的示意图：旋转式反应器内筒1，旋转式反应器外筒2，含有明胶微球、硫酸软骨素及细胞的海藻酸钙微胶珠3，硫酸软骨素分子4，神经前体细胞球5，明胶微球形成的空洞6，单个分化细胞7；

图2为普通海藻酸钠组、常规钙浓度组、无明胶微球组、无硫酸软骨素组、静态培养组以及模拟微环境组中Nestin阳性细胞比例；

图3为普通海藻酸钠组、常规钙浓度组、无明胶微球组、无硫酸软骨素组、静态培养组以及模拟微环境组中Nestin阳性细胞总数；

图4为200mM钙液组、20KDa硫酸软骨素组、海藻酸钠/硫酸软骨素质量比为9对照组(ALG/CS＝9)，两种多肽1:1混合组以及模拟微环境组中Nestin阳性细胞比例；

图5为200mM钙液组、20KDa硫酸软骨素组、海藻酸钠/硫酸软骨素质量比为9对照组(ALG/CS＝9)，两种多肽1:1混合组以及实验组中Nestin阳性细胞总数。

具体实施方式

实施例1：促进人脐带来源间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化和增殖

首先，分别制备精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)及酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)修饰的海藻酸钠。具体方法为将海藻酸钠(分子量500kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比2)溶解于含有0.5MNaCl的0.1M2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中(pH值6.5)，得到1％(W/V)(单位为g/mL)海藻酸钠溶液。再分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和RGD、IKVAV或YIGSR多肽，室温搅拌反应24小时。EDC和海藻酸钠摩尔比为1:20，EDC和sulfo-NHS摩尔比为2:1，三种多肽和海藻酸钠质量比均为1:1000。然后进行透析并冷冻干燥，从而得到RGD、IKVAV或YIGSR修饰的三种海藻酸钠。将三种多肽修饰海藻酸钠粉末按照质量比1:1:1溶解于生理盐水中，得到总浓度3％(W/V)(单位为g/mL)的混合海藻酸钠溶液。

之后，将硫酸软骨素(平均分子量30kDa)粉末溶解于生理盐水中，得到10％(W/V)(单位为g/mL)的溶液。将3％(W/V)(单位为g/mL)混合海藻酸钠溶液、10％(W/V)(单位为g/mL)硫酸软骨素溶液以及生理盐水混合，得到海藻酸钠终浓度为2％(W/V)(单位为g/mL)，海藻酸钠/硫酸软骨素质量比为4:1的混合溶液。

然后，将10％(W/V)(单位为g/mL)酸性明胶溶液滴加到无菌油酸乙酯中，经过1000rmp搅拌10min，使用冰水浴冷却10min，并PBS清洗去除油相得到直径约150μm的明胶微球。将明胶微球和上述海藻酸钠/硫酸软骨素/生理盐水混合溶液按照体积比1:10的比例混合，再加入5×10⁶cells/mL(以海藻酸钠/硫酸软骨素/生理盐水混合溶液体积为基准)第4代人脐带间充质干细胞，混合均匀。之后，将上述混合液滴加到预冷的氯化钙溶液中(200mM)(作为高钙组)，反应30min，清洗后使用含有1％N₂、20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF的DMEM/F12培养液重悬，转移到旋转式反应器中培养10天，作为模拟微环境组。

设置一系列对照组，包括使用普通海藻酸钠组、常规钙浓度组(100mM)、无明胶微球组、无硫酸软骨素组、静态培养组，各组其它条件保持一致。所有组均培养10天，之后收获细胞，利用流式细胞仪分析Nestin阳性细胞比例以及总数，以评价分化效率和扩增情况。

实验结果图2与3显示，高钙条件下制备的、含有明胶微球及硫酸软骨素的多肽修饰海藻酸钙微胶珠在因子以及旋转反应器的支持下，即模拟微环境组的分化效率和细胞扩增均显著高于其它对照组，也证明这些关键因素对于间充质干细胞向神经前体细胞分化及增殖是必须的。

实施例2：促进人骨髓来源间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化和增殖

RGD、IKVAV及YIGSR修饰海藻酸钠的制备同实施例1。将三种多肽修饰海藻酸钠粉末按照质量比1:1:1溶解于生理盐水中，得到总浓度3％(W/V)(单位为g/mL)的混合海藻酸钠溶液。

之后，将硫酸软骨素(平均分子量40kDa)粉末溶解于生理盐水中，得到10％(W/V)(单位为g/mL)的溶液。将3％(W/V)(单位为g/mL)修饰海藻酸钠、10％(W/V)(单位为g/mL)硫酸软骨素溶液以及生理盐水混合，得到海藻酸钠终浓度为2％(W/V)(单位为g/mL)，海藻酸钠/硫酸软骨素质量比为2.3的混合溶液。

然后，将10％(W/V)(单位为g/mL)酸性明胶溶液滴加到无菌油酸乙酯中，经过1000rmp搅拌10min，使用冰水浴冷却10min，并PBS清洗去除油相得到直径约150μm的明胶微球。将明胶微球和上述海藻酸钠/硫酸软骨素/生理盐水混合溶液按照体积比1:10的比例混合，再加入8×10⁶cells/mL(以海藻酸钠/硫酸软骨素/生理盐水混合溶液体积为基准)第3代人骨髓来源间充质干细胞，混合均匀。之后，将上述混合液滴加到预冷的氯化钙溶液中(300mM)，反应30min，清洗后使用含有1％N₂、20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF的DMEM/F12培养液重悬，转移到旋转式反应器中培养10天，作为实验组。

设置一系列对照组，包括200mM钙液组、20KDa硫酸软骨素组、海藻酸钠/硫酸软骨素质量比为9对照组(ALG/CS＝9)，两种多肽1:1混合组，各组其它条件保持一致。所有组均培养10天，之后收获细胞，利用流式细胞仪分析Nestin阳性细胞比例以及总数，以评价分化效率和扩增情况。

实验结果图4与5显示，钙离子浓度、硫酸软骨素分子量、海藻酸钠/硫酸软骨素质量比以及多肽种类对间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化和增殖具有明显的影响。实验组对于分化和增殖的促进作用最为明显。