新型人源化抗CD20单克隆抗体的表达和活性检测

摘要

B细胞淋巴瘤是发生在B细胞的实体肿瘤，主要可以分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)。NHL在血液系统恶性肿瘤中十分常见，对人类生命健康造成极其严重的威胁。但到目前为止，临床上传统的化疗药物对NHL的治疗效果并不理想，科学家正在研发各种新型药物来治疗NHL。单克隆抗体因为其高特异性和靶向性而发展迅速。B淋巴细胞抗原CD20是人类B淋巴细胞表面上所特有的标识，主要由297个氨基酸构成。根据不同的磷酸化水平，CD20的分子量为33-37kD，属于非糖基化磷蛋白。CD20分子是一种有四个跨膜区的跨膜蛋白，它的N端和C端都位于细胞质内侧。CD20分子的主要抗原表位位于第三、四跨膜区之间，是一个由43个氨基酸组成的环状区域。从前体B细胞到后来的分化过程，CD20广泛表达于B细胞的表面，但是不表达于晚期分化的浆细胞中。CD20表达于B细胞发展的除了最初和最后以外的所有阶段。CD20在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑色素瘤肿瘤干细胞中均被发现。CD20分子位于B细胞膜表面，抗体接近的空间位阻较小，因此CD20分子成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。虽然CD20的功能尚未完全清楚，但是它在Ca2+跨膜传递，维持细胞内Ca2+聚集和B细胞激活方面发挥着重要作用。
　　Rituximab是一种与B细胞表面CD20分子特异性结合的人/鼠嵌合型单克隆抗体。Rituximab是一种糖基化IgG1κ免疫球蛋白，其中鼠源来自于鼠抗CD20单抗的可变区Fab段，人源来自于人IgG1抗体稳定区Fc段。Rituximab由1328个氨基酸组成，分子量约为144Kd。Rituximab由IDEC公司研发，药品名称是IDEC-C2B8。因为Rituximab具有杀伤B细胞的功能因此被用于治疗以B细胞过量表达，B细胞过度活化或B细胞功能失调为特点的相关疾病，例如:白血病、淋巴瘤、移植排斥反应和自身免疫性疾病。基于其临床试验中显示的安全性和有效性，美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)在1997年批准Rituximab用于治疗对于其他化疗方案无效的B细胞非霍奇金淋巴瘤。2010年欧盟委员会批准Rituximab用于滤泡性淋巴瘤初始治疗后的维持治疗。在三组随机对照试验中，Rituximab已经被证明是一种有效治疗类风湿性关节炎的药物，现在已经批准用于难治愈型类风湿性疾病的治疗。美国FDA批准Rituximab与甲氨蝶呤(MTX)联合用于治疗对抗TNFα治疗反应不足的中度至严重活动性成人类风湿关节炎。在欧洲，Rituximab仅被批准与甲氨蝶呤联合治疗抗TNFα治疗反应不足的严重活动性类风湿关节炎。其他Rituximab治疗的自身免疫性疾病包括:自身免疫性溶血性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、埃文斯综合症、血管炎、大疱的皮肤疾病、Ⅰ型糖尿病、干燥综合征、德维克病和Graves眼病等。
　　Rituximab是一种人鼠嵌合型的抗CD20单克隆抗体，具有30％左右的鼠源蛋白，因此长期使用会引起免疫原性。因此，寻求更为有效的抗CD20抗体用于B淋巴瘤的治疗显得尤为迫切。
　　我们通过计算机模建技术，在蛋白质结构数据库中找到与Rituximab空间结构最相近的人IgG1为骨架，将Rituximab的CDR区进行移植和改造，通过重叠PCR方法，扩增出目的基因片段。分别将轻、重链基因片段克隆到载体pcDNA3.3、Poptivec质粒上。瞬时转染至293F细胞，收取细胞上清，用rProteinA亲和层析法纯化目的抗体，并用SDS-PAGE检验抗体的表达量，采用Fortebio技术检测抗体与抗原的结合能力，最后进行裸鼠移植瘤生长抑制实验以检验抗体的抗肿瘤活性。结果显示:抗体的轻、重链质粒已经被成功构建，并且顺利的转染和表达，最终纯化得到13种目的抗CD20人源化抗体。抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25Kd和55Kd两条带，与预计条带大小相符;Fortebio实验结果表明，13组抗体与抗原具有良好的亲和活性，其中:L4H7抗体的Kd值为1.91×10-9mol/L、L5H5抗体的Kd值为7.35×10-10mol/L、L5H7抗体的Kd值为1.91×10-9mol/L。裸鼠移植瘤生长抑制实验表明，L5H7抗体的抗肿瘤活性优于Rituximab。下一步，我们将增加实验动物的数量，进一步验证抗体L5H7的抗肿瘤活性和安全性，以期获得亲和力更强，抗肿瘤活性更高并且副作用更少的安全有效的人源化抗CD20单克隆抗体，为临床上NHL的有效治疗提供了新的手段。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

1 恶性淋巴瘤

1．1 背景

1．2 分类

1．3 病因

1．4 临床症状

1．5 检查和诊断方法

1．6 分期

1．7 治疗手段

2 抗CD20单克隆抗体药物

2．1 第一代抗CD20治疗性单克隆抗体药物

2．2 第二代抗CD20治疗性单克隆抗体药物

2．3 第三代抗CD20治疗性单克隆抗体药物

3 研究目的意义

第二部分 材料与方法

1 材料

1．1 细胞株及实验动物

1．2 菌株及质粒

1．3 工具酶及抗体

1．4 试剂及试剂盒

1．5 培养基

1．6 耗材

1．7 缓冲液

1．8 主要仪器设备

2．实验方法

2．1 构建CD20-L、CD20-H克隆

2．2 细胞培养、冻存与转染

2．3 蛋白质的纯化浓缩

2．4 SDS-PAGE电泳

2．5 考马斯亮蓝染色

2．6 Fortebio测亲和力

2．7 抗体的体外功能研究

2．8 裸鼠移植瘤生长抑制试验

第三部分 结果

3．1 抗体基因片段的克隆

3．1．1 引物的设计与合成

3．1．2 pMD18-T-L和pMD18-T-H质粒的构建与鉴定

3．2 表达载体的构建

3．3 抗体的表达纯化和鉴定

3．3．1 抗体的表达和纯化

3．3．2 抗体的还原／非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．4 抗体的抗体结合活性的Fortebio检测

3．5 抗体的体外功能研究

3．5．1 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)

3．5．2 补体依赖的细胞毒作用(CDC)

3．6 裸鼠移植瘤生长抑制实验结果

4 总结

4．1 本研究主要获得的结果

4．2 本研究的创新之处

4．3 需进一步研究的问题

讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文