疱疹病毒通过抑制组蛋白H1.2的表达来阻止宿主细胞的凋亡

摘要

凋亡是多细胞生物体单个细胞在受到重要的多种外界刺激后经历的系统性自我更新毁灭的一个过程。凋亡是基因调控的一个程序性事件，在发育过程中当细胞变的多余时用于删除多余的细胞，或者是作为应对辐射损害、致癌基因导致的畸形生长以及病毒感染突发事件的一个反应。
　　在病毒感染的细胞中，引起宿主细胞早期的凋亡会很严重地限制病毒的产生，减少或消除病毒后代在宿主细胞中的传播，而疱疹病毒潜伏和裂解感染都能引起宿主细胞凋亡。为了保证潜伏期病毒基因组DNA存活以及疱疹病毒完成裂解复制周期，病毒都有自己的机制策略来阻止凋亡的即将发生和发生。组蛋白H1.2作为连接组蛋白一个变体，在凋亡信息由细胞核到细胞质的传导中起着重要作用。为了验证疱疹病毒是否通过调节H1.2而影响细胞凋亡，我们用qRT-PCR以及western-blot等方法在HSV-1和HCMV感染后的细胞中提取RNA和蛋白，发现疱疹病毒感染导致H1.2的RNA和蛋白水平下降。为了研究其作用机理，我们对HSV-1感染的BJ细胞进行了RNA PolⅡ的ChIP-seq分析，发现HSV-1感染BJ细胞后能有效地降低有转录活性的RNA PolymeraseⅡ在组蛋白H1.2基因上的结合，而其它组蛋白基因不受影响。同时这些结果表明疱疹病毒在转录水平上抑制组蛋白H1.2表达来阻止宿主细胞凋亡。
　　H1.2必须从细胞核释放到细胞质结合线粒体进而发挥激活凋亡的作用。为了验证疱疹病毒是否调节这一过程，我们首先用一种引起DNA双链断裂发生凋亡的化学药物Etoposide处理细胞，发现H1.2从细胞核中释放出来，随后我们用免疫荧光实验观察病毒感染之后组蛋白H1.2定位变化。组蛋白H1.2在病毒感染之后仍然位于核内，这也暗示着HSV-1可能阻断组蛋白H1.2由细胞核向细胞质释放的过程。
　　由于病毒干预细胞凋亡过程有利于病毒完成复制或潜伏，病毒因子很有可能有参与这一过程。在本实验中我们通过转染病毒的一些抗凋亡蛋白来寻找调控组蛋白H1.2的蛋白因子，通过qRT-PCR以及western-blot等实验我们找到了影响H1.2表达的病毒蛋白因子:ICP4、ICP22、ICP27和ICP34.5。最重要的实验是构建组蛋白调控区的报告载体，会在以后通过双荧光素酶检测系统来寻找病毒调控组蛋白H1.2基因表达的机制。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 疱疹病毒

1．1．1 单纯疱疹病毒简介

1．1．2 巨细胞病毒简介

1．1．3 EB病毒简介

1．2 组蛋白简介

1．2．1 组蛋白H1简介

1．2．2 组蛋白H1．2简介

1．3 疱疹病毒抗凋亡研究进展

1．3．1 LATS (the latency-associated transcripts)

1．3．2 Us3

1．3．3 ICP27

1．3．4 gJ

1．3．5 ICP22 (infected cell protein 22)

1．3．6 gD

1．3．7 ICP4(infected cell protein 4)

1．4 本课题的研究意义及内容

1．4．1 本文的研究内容

1．4．2 本文的研究意义

第二章 疱疹病毒感染之后组蛋白H1．2的表达

引言

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 主要试剂和耗材

2．1．3 试剂配制

2．2 方法

2．2．1 细胞复苏

2．2．2 细胞培养

2．2．3 疱疹病毒扩增

2．2．4 疱疹病毒滴度的测定

2．2．5 疱疹病毒感染BJ、MRC-5实验

2．2．6 QIAGEN试剂盒提取RNA

2．2．7 RNA的琼脂糖凝胶电泳

2．2．8 RNA反转录

2．2．9 引物设计和合成

2．2．10 SYBR Green Q-PCR反应

2．2．11 组蛋白H1．2提取

2．2．12 组蛋白H1．2 Western blot实验

2．2．13 数据分析

2．3 结果

2．3．1 疱疹病毒感染BJ之后提取RNA的凝胶电泳

2．3．2 疱疹病毒感染之后RT-qPCR定量分析

2．3．3 蛋白印记

2．3．4 RNA Pol Ⅱ ChIP-seq数据

2．4 讨论

第三章 疱疹病毒感染对组蛋白H1．2定位的影响

引言

3．1 材料

3．1．1 主要仪器及设备

3．1．2 主要试剂及耗材

3．1．3 细胞及药物

3．1．4 试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 细胞复苏

3．2．2 细胞培养

3．2．3 疱疹病毒扩增

3．2．4 病毒滴度测定

3．2．5 单纯疱疹病毒感染Hela细胞实验

3．2．6 Etoposide处理细胞

3．2．7 免疫荧光实验

3．3 结果

3．3．1 单纯疱疹病毒感染Hela细胞

3．3．2 Etoposide处理Hela细胞

3．4 讨论

第四章 疱疹病毒的抗凋亡蛋白对H1．2表达量影响

引言

4．1 材料

4．1．1 主要仪器及设备

4．1．2 试剂及耗材

4．1．3 细胞及药物

4．1．4 转染试剂

4．2 方法

4．2．1 细胞复苏

4．2．2 细胞培养

4．2．3 制备大肠杆菌感受态细胞

4．2．4 单纯疱疹病毒抗凋亡基因质粒扩增

4．2．5 Lipofeetamine 2000转染单纯疱疹病毒抗凋亡基因质粒

4．2．6 TRIzol试剂提取RNA

4．2．7 RNA反转录

4．2．8 引物设计和合成

4．2．9 SYBR Green qPCR反应

4．2．10 组蛋白H1．2提取

4．2．11 组蛋白H1．2 Western blot实验

4．3 结果

4．3．1 转染m-cherry质粒

4．3．2 单纯疱疹病毒抗凋亡蛋白转染Hela细胞之后RT-qPCR定量分析

4．3．3 单纯疱疹病毒抗凋亡蛋白转染Hela细胞之后的蛋白印记

4．讨论

第五章 组蛋白H1．2启动子构建

引言

5．1 材料

5．1．1 主要仪器及设备

5．1．2 试剂及耗材

5．1．3 试剂配制

5．2 方法

5．2．1 引物设计和合成

5．2．2 BJ细胞基因组DNA提取

5．2．3 1#序列基因pcr扩增

5．2．4 2#和3#序列基因的pcr扩增

5．2．5 PCR产物胶回收

5．2．7 双酶切质粒和片段的连接

5．2．8 新构建质粒的转化及提取

5．3 结果

5．3．1 1#、2#、3#序列扩增

5．3．2 质粒及胶回收产物双酶切

5．4 讨论

第六章 总结

参考文献

附录：缩略词表

致谢