银杏内共生真菌的分离及其产黄酮特性的研究

摘要

内共生真菌(Endophytic fungi)，现在的定义是泛指一些不引起植物组织明显病害症状，生活史中的某一阶段在植物的组织内生活的微生物，也包括那些对宿主植物暂时没有伤害的潜伏性病原微生物和菌根菌。当研究报道安德鲁紫杉菌（Taxomyces andreanae），一种能产生紫杉醇的内共生真菌，从短叶红豆杉的韧皮部中分离得到，这引起了人们研究裸子植物内共生真菌抗肿瘤活性的极大兴趣。为了解决资源问题，近年来药用植物内生菌成为药用植物新资源研究的的一个热点。
　　本文以我国的特有植物—银杏（Ginkgo bilobaL.）为实验材料，对安徽舒城和合肥地区的银杏的根、茎、叶组织的内共生真菌进行分离，实验采用75％的乙醇对实验材料进行表面消毒，多次重复实验结果表明，银杏不同组织部位的最佳消毒时间分别为:银杏的根为3min，银杏的茎为2min，银杏的叶为1min。在此条件下，采用尖端挑取的方法，对银杏的根、茎、叶组织中的真菌进行分离纯化，共得到60株内共生真菌，根据菌落的形态，颜色进行初步的形态学分析，排除所得的相同菌落，最终获得20株银杏内共生真菌。
　　通过形态学进行初步鉴定，显微摄影显示内共生真菌在生长过程中的菌丝大都是透明的，并且是无隔的，基本属于单端孢霉属，鞘孢属，轮枝孢属这三大属。本文通过结合显色法、氯化铝比色法、薄层层析法对分离出来的内共生真菌的发酵产物进行初步的定性分析，从而筛选出可以产黄酮的菌株。实验表明，若发酵产物中含有黄酮类物质，则发酵产物与氯化铝反应，部分呈现黄绿色荧光。发酵产物与氢氧化钠反应，部分有黄色出现。发酵产物与硼酸反应，部分出现棕黄色。反之则没有此类现象。
　　继而采用超高压液相色谱的方法对产黄酮菌株发酵进行定量分析，从而筛选出具有高产黄酮性能的菌株。实验表明:经过发酵复筛有5株菌株的产黄酮能力超过5μg/mL。
　　实验进一步对5株高产黄酮的菌株的发酵产物进行了活性鉴定，分别测定了发酵产物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果的强弱。实验表明，五种发酵液均有抑菌活性，且No.2013015菌株的抑菌效果最佳，后续的实验选No.2013015为实验菌株。
　　本文最后从发酵培养基和培养条件两方面对实验菌株液体发酵条件进行了探索，得出该系菌株液体发酵产黄酮的最佳条件。实验表明，该系菌种最佳产黄酮发酵培养基条件为:3％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.4％酵母膏、0.3％KH2PO4、0.01％MgSO4·7H2O;最佳培养条件为:起始pH值7.0、最适发酵温度28℃、摇床转速为140r/min、装液量125mL/250mL;这为实现工业化大生产提供了理论的依据，具有较好的借鉴价值和指导意义。
　　银杏黄酮药物需求越来越多，几乎处于供不应求的状态，仅仅靠从银杏叶中提取黄酮类物质，会造成资源的缺乏，以及对生态环境造成破坏。然而，真菌具有易培养、生长快、易控制等特点，故其拥有十分广阔应用前景，可以为银杏黄酮类物质的开发寻找新途径。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1、植物内共生真菌的研究进展

1．1 内生菌的简介

1．2 内共生真菌多样性的研究

1．3 内共生真菌的生物学作用及其与宿主的关系

1．4 药用植物内共生真菌的研究及其活性代谢产物

1．5 国内外植物内共生真菌及其活性代谢产物的研究进展

2、银杏内共生真菌的研究概况

2．1 银杏的简介

2．2 银杏的药用价值

2．3 银杏内共生真菌的研究概况

3、本研究的内容及技术路线

4、本研究的目的与意义

5、本研究的创新点

第二章 银杏内共生真菌的分离与纯化

1、材料与方法

1．1 菌种分离的材料

1．2 试剂与仪器设备

1．3 培养基

1．4 内共生真菌分离纯化的方法

1．5 菌种保藏的方法

2、结果与分析

2．1 实验材料消毒时间的确定

2．2 内共生真菌的分离结果

第三章 银杏内共生真菌的鉴定

1、实验材料

1．1 供试菌株

1．2 试剂与仪器设备

1．3 培养基

2、内共生真菌的形态学鉴定

2．1 观察描述方法

2．2 培养性状的观察要点

2．3 微观形态观察要点

2．4 标本的制作

2．5 显微摄影拍照

2．6 菌种的鉴定

3、结果与分析

第四章 No．2013015菌株液体发酵产物的理化性质的研究

1、实验材料

1．1 菌种

1．2 试剂与仪器设备

1．3 培养基

2、实验方法

2．1 菌种的活化

2．2 种子的制备

2．3 液体发酵

2．4 产物的提取

2．5 产物的初步鉴定

2．6 UPLC检测其产物的含量

3、结果与分析

3．1 产物的初步鉴定

3．2 产物的超高压液相色谱

第五章 No．2013015菌株液体发酵条件的优化

1、实验材料

1．1 菌种

1．2 试剂与仪器设备

1．3 培养基

2、实验方法

2．1 发酵培养基的优化

2．2 培养条件的优化

3、结果与分析

3．1 发酵培养基的优化

3．2 培养条件的优化

第六章 No．2013015菌株液体发酵产物抑菌活性的研究

1、实验材料

1．1 菌种

1．2 主要试剂与仪器

1．3 发酵培养基的选择

2、实验方法

2．1 No．2013015菌株的液体发酵

2．2 发酵产物抑菌活性的研究

3、结果与分析

结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表学术论文情况