利用酵母双杂交系统筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白

摘要

果蝇作为经典的模式生物，不仅在经典遗传学中得到广泛应用，其许多分子机制在进化上与哺乳动物是高度保守的，尤其在卵子发生这一系统中。相对于其他模式生物而言，果蝇具有相对简单的发育过程。我们希望通过对果蝇生殖系统的研究，来揭示减数分裂早期事件，提高我们对减数分裂的认识。
　　联会复合体(SC)是由减数分裂前期Ⅰ中各种蛋白成分装配形成的一种超级复合结构，它是由LEs、TFs和CE三种成分共同组成。它起始于减数分裂前期Ⅰ的偶线期，于双线期开始解体。联会复合体正常的装配和解体，对于同源染色体的配对、联会、交叉互换以及染色体的分离是必需的。
　　C(2)M作为减数分裂特异性蛋白，参与SC的装配。根据分子实验和生物信息学分析，它既同C(3)G共同形成LE元件，参与C(3)G的定位;又与α-kleisin蛋白家族具有相似的功能:与cohesin蛋白家族相互作用，连接SMC1和SMC3，聚集姐妹染色单体。对于卵子的形成发挥着重要的作用。由于联会只发生在减数分裂Ⅰ期，持续时间短，并且结构微小，以目前的分辨率还无法观察到SC的结构。C(2)M作为SC结构的组成成分，我们希望从这一点入手，探究与C(2)M相互作用的蛋白，试图揭示SC复合体的组成、装配，以及减数分裂的分子过程。
　　我们选取C(2)M为诱饵蛋白，设计引物以果蝇cDNA为模板，PCR扩增C(2)M的CDS区，并以NcoⅠ和XhoⅠ构建了pGBKT-7-C(2)M这一表达载体。通过LiAc溶液介导转入酵母细胞中，并用Western检测诱饵蛋白在酵母AH109菌株中是否表达，在SD/-Ade/-Leu/-Trp和SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp缺陷培养基上检测诱饵蛋白是否能自激活报告基因的表达。将文库质粒转入含诱饵质粒的AH109中，通过SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp缺陷培养基的筛选，挑出文库中与C(2)M相互作用的蛋白质。并提取所有阳性酵母克隆的质粒，将其转入大肠杆菌细胞中，扩增文库质粒。将所得的阳性文库质粒回转含pGBKT-7-C(2)M质粒的AH109中，验证相互作用;以及回转含pGBKT-7空载质粒的AH109中，验证阳性文库质粒的自激活现象。最后，我们将既能通过回复验证、又没有自激活现象的阳性文库质粒送去生物公司测序，并经过生物信息学分析，排除杂蛋白的干扰。结合文献及现有资料，从中选取两个基因构建转基因果蝇，在生殖细胞中进行了RNA水平的敲低，通过染色观察这两个基因对减数分裂的影响。
　　通过酵母双杂实验，我们共挑出154个克隆，去除9个回复验证失败和54个自激活组别后，得到91个阳性克隆。测序后，将这91个克隆在NCBI上比对，得到40个与C(2)M存在相互作用的蛋白，这其中包括众多的染色质结合蛋白。对Wech和Psf1这两个基因在生殖细胞中进行了RNA水平的敲低后，免疫荧光观察结果显示，在Wech和Psf1敲低的果蝇生殖细胞中，染色质的联会受到了干扰，联会复合体的消失出现延迟现象，即最后有两个细胞形成了生殖细胞。这种结果说明Wech和Psf1具有促进联会复合体解聚的功能。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 模式生物果蝇

1．2 果蝇生殖系统

1．2．1 卵子的发生

1．2．2．研究方法

1．2．3 减数分裂简介

1．2．4 联会复合体

1．2．5 C(2)M

1．2．6 研究问题

1．3 蛋白质相互作用的研究方法

1．3．1 串联亲和纯化

1．3．2 蛋白质芯片

1．3．3 荧光共振能量转移技术

1．3．4 酵母双杂交技术

第二章：实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂和购买公司

2．1．2 载体

2．1．3 引物

2．1．3 菌株

2．1．4 培养基配制

2．2 实验方法

2．1．1 扩增c(2)M的CDS片段及片段和载体pGBKT-7的酶切、回收、连接

2．1．2 大肠杆菌DH5 α感受态的制备及连接产物转化、鉴定

2．1．3 小提大肠杆菌质粒

2．1．4 诱饵载体pGBKT7-c(2)M转化AH109酵母菌株

2．1．5 制备酵母蛋白样品

2．1．6 检测C(2)M是否能自激活报告基因

2．1．7 果蝇的cDNA文库转化含有pGBKT7-c(2)M的AH109菌株

2．1．8 阳性克隆的保种

2．1．9 提取酵母质粒

2．1．10 将酵母质粒转化大肠杆菌

2．1．11 PCR鉴定阳性克隆里的质粒是否为文库质粒

2．1．12 阳性质粒的自激活和回复验证

2．1．13 显微注射质粒的构建

2．1．14 转基因果蝇的构建

2．1．15 免疫荧光观察

2．1．16 S2细胞的复苏

2．1．17 S2细胞的传代

2．1．18 S2细胞的转染

2．1．19 免疫共沉淀

第三章：实验结果与分析

3．1 pGBKT7-c(2)M的构建

3．1．1 扩增c(2)M的CDS片段

3．1．2 片段和载体pGBKT-7的酶切

3．1．3 pGBKT7-c(2)M的鉴定

3．1．4 分析

3．2 western blot检测pGBKT-7-c(2)M融合蛋白的表达

3．2．1诱饵载体pGBKT7-c(2)M转化AH109酵母菌株

3．2．2 c(2)M在AH109菌株中的表达

3．2．3 分析

3．3 筛选果蝇cDNA文库

3．3．1 诱饵蛋白c(2)M自激活检测

3．3．2 文库筛选结果

3．3．3 分析

3．4 文库质粒的提取及自激活和回复验证

3．4．1 PCR鉴定文库质粒

3．4．2 阳性质粒自激活和回复验证

3．4．3 分析

3．5 阳性质粒测序和生物信息学分析

3．5．1 筛选结果的统计

3．5．2 部分基因的生物信息学分析

3．6 wech和Psf1的基因沉默型果蝇的构建以及表型的初步分析

3．6．1 knockdown质粒的构建

3．6．2 wech和Psf1表型的免疫荧光观察

3．6．3 分析

3．7 C(2)M与wech和Psf1相互作用的分析

3．7．1 免疫共沉淀检测C(2)M与wech和Psf1的相互作用

3．7．2 分析

第四章：结论与展望

8．1 结果

8．2 讨论

8．3 展望

参考文献

致谢