宿主限制因子APOBEC3G/F和其它干扰素相关基因的表达对HIV-1感染北平顶猴(Macaca leonina)的影响及可能机制

摘要

灵长类动物是人类重大疾病研究的首选实验动物，其研究成果更易临床转化，可大大降低新药研发的风险。在HIV研究领域，构建类似于人感染HIV-1的HIV/AIDS灵长类动物模型仍是追求的目标。研究显示大部分猕猴可以感染SIV病毒，三个物种被广泛的使用作为AIDS动物模型:恒河猴(Macaca mulatta)，食蟹猴（Macaca fascularis）和平顶猴（Macaca nemestrina）。由于SIV与HIV-1的基因型的差异，所以构建的SIV/AIDS灵长类动物模型本身就存在缺陷，而使用HIV-1病毒去构建AIDS动物模型必将对艾滋病的预防和治疗起到推动作用。平顶猴是唯一可感染HIV-1的旧大陆猴。北平顶猴属于平顶猴的一个物种，广泛地分布在中国和东南亚等国家。我们实验室首次发现北平顶猴中由于存在TRIM5-CypA的融合，导致北平顶猴缺失了能够限制HIV-1复制的宿主限制因子TRIM5α，体外证实HIV-1可以感染北平顶猴PBMCs，甚至改造过的stHIV-1sv病毒有更强的感染能力。从而在分子和细胞水平上证实了北平顶猴是潜在的比较理想的艾滋病模型动物。
　　研究证实另一类限制因子APOBEC3G和APOBEC3F具有强的抗HIV-1作用，这类限制因子可被Ⅰ型干扰素诱导产生。HIV-1病毒感染细胞后，诱导产生Ⅰ型IFNs并通过JAK-STAT通路诱导ISGs表达发挥抗病毒作用;同时在这一过程中干扰素基因、干扰素信号基因以及调控基因也会被诱导表达，这些干扰素相关基因的表达可能反映出病毒在感染机体中的复制情况。也有研究证实干扰素在抑制病毒复制的同时也增加CD4+T细胞的消耗，加速疾病进程。
　　所以本研究使用新型HIV-1R3A(以HIV-1NL4.3为骨架，env基因替换成疾病进程更快的HIV-1R3A)和stHIV-1 sv（以HIV-1NL4.3为骨架，env基因区替换成SHIV-KB9，并且替换了SIVmac239的vif基因）病毒分别感染4只北平顶猴以初步研究北平顶猴AIDS动物模型建立的可行性;对HIV-1感染北平顶猴的免疫学和病毒学指标进行检测，结果显示2种病毒分别感染北平顶猴后，其血浆病毒载量在感染后第1-2周达到峰值，随后持续下降，在急性期被迅速的抑制。另外stHIV-1sv感染北平顶猴，其血浆病毒载量明显高于HIV-1R3A感染。虽然感染后CD4+T细胞有强烈的波动，却无显著的下降。同时stHIV-1 sv感染北平顶猴后，其体内能够更早的产生抗体和中和抗体，产生强血清学应答控制病毒复制。该研究显示stHIV-1sv病毒更利于构建北平顶猴AIDS动物模型，并且该模型的特点类似于人类感染HIV-1后的长期非进展者。HIV-1感染北平顶猴后，病毒复制水平受到明显抑制。为进一步寻找导致HIV-1在北平顶猴体内低水平复制的原因，我们研究了干扰素相关基因的表达和限制因子APOBEC3G/F的作用。结果表明stHIV-1 sv病毒感染北平顶猴后，整合病毒env区显示出较少的APOBEC3家族引起的突变，而HIV-1R3A病毒感染北平顶猴后，其整合env区存在大量的APOBEC3家族引起的突变。本研究提示替换vif的stHIV-1 sv病毒可较好的拮抗APOBEC3G/F的抗病毒作用，较HIV-1R3A病毒易感北平顶猴;但在急性期病毒复制被迅速控制，可能原因是干扰素相关基因在急性期被上调，尤其可能是ISGs上调发挥抗病毒作用。干扰素相关基因表达在感染1-3周达到峰值，随后逐渐下降到感染前水平或低于感染前水平，并且有的基因表达在感染24周出现上升的趋势，整体上干扰素相关基因的表达趋势与病毒载量的变化趋势相一致。
　　综上所述，本论文研究检测了HIV-1感染北平顶猴的病毒学和免疫学指标，并且对急性期控制病毒复制的因素进行了研究，发现APOBEC3G和APOBEC3F上调可引起病毒序列的突变，从而抑制病毒复制。另外，其它干扰素相关基因在急性期的表达上调也可能影响病毒的复制。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 灵长类AIDS动物模型研究概述

1．1．1 恒河猴研究

1．1．2 食蟹猴研究

1．1．3 平顶猴研究

1．2 干扰素对HIV／SIV复制影响的研究进展

1．2．1 干扰素的分类

1．2．2 病毒刺激IFNs产生和ISGs表达的信号通路

1．2．3 干扰素发挥抗HIV／SIV病毒的作用

1．2．4 干扰素促进HIV／SIV毒复制的作用

1．3 现存问题和展望

1．4 本研究的目的

第二章 北平顶猴感染HIV-1免疫学和病毒学主要指标检测

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验动物和样品采集

2．2．2 病毒类型和攻毒时间

2．2．3 实验试剂与溶液

2．2．4 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 血浆病毒载量和免疫细胞的检测

2．3．2 抗体中和抗体的变化

2．3．3 CD4+T和CD8+T细胞亚群的变化

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 宿主限制因子APOBEC3G／F和其它干扰素相关基因的表达对HIV-1复制的影响

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 样品选取

3．2．2 实验试剂和溶液

3．2．3 实验仪器

3．2．4 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 扩增整合病毒env区和构建病毒突变图谱

3．3．2 干扰素相关基因的表达情况

3．3．3 IFNs相关基因的相对表达热度图

3．3．4 两种病毒的病毒载量与急性期基因表达之间的相关性

3．4 讨论

3．5 小结

参考文献

致谢

作者简历和在读期间发表论文