pH敏感壳聚糖纳米凝胶药物载体的制备及其抗肿瘤活性

摘要

化疗仍是目前临床中治疗恶性肿瘤的主要方法之一。然而，大多数的传统化疗药物，如紫杉醇、顺铂、阿霉素等，由于在体内缺乏特异肿瘤靶向性导致的非特异性分布所带来的一些副作用严重限制了其在临床中的应用。近年来，基于纳米技术的药物缓释系统的迅速发展为解决这些问题提供了一条有效途径。纳米药物载体所包括的如纳米微球、纳米胶束、纳米囊泡，纳米凝胶等，可以有效的负载抗肿瘤药物并在肿瘤细胞内可以实现药物的缓控释放。此外，增强渗透和保留(EPR)效应能增强纳米药物载体在肿瘤部位的富集，进而提高肿瘤组织处的药物浓度和增强化疗疗效，同时能降低传统药物的毒副作用。在这些众多的纳米药物载体中，纳米凝胶由于具有结构可调节性、良好的稳定性、较高的载药能力和可控型药物释放能力，而被广泛应用于各种纳米药物输送体系的构建。
　　良好的生物相容性是药物传递系统的另一关键因素。目前，各种可生物降解和良好生物相容性的天然高分子，如透明质酸、海藻酸钠及壳聚糖等已被用于制备纳米凝胶。其中，壳聚糖因具有良好的生物相容性、可降解性、无毒性和低免疫性等优点，在药物、基因传递和组织工程等领域得到了普遍应用。然而，由于高分子量的壳聚糖在中性或碱性水溶液中较差的水溶性而限制了其作为药物载体的应用。本文选择壳聚糖为起始原料并对其进行化学修饰改性来制备纳米凝胶。首先，通过丁二酸酐修饰壳聚糖使其含有羧基基团，不仅可以提高壳聚糖在中性和碱性水溶液中的溶解性，而且会使壳聚糖带有负电荷。这种表面带有负电荷的纳米凝胶可以有效的避免其在血液中的聚集，使其具有更长的血液循环，进而增强药物在肿瘤组织中的积累。
　　虽然血液长循环和EPR效应能显著增强纳米凝胶在肿瘤组织处的富集，可是，另一关键性问题在于纳米凝胶如何在肿瘤组织处实现响应性的药物释放。为了解决这一难题，各种环境响应型（例如:酶，pH，氧化还原，温度等）纳米凝胶已被广泛发展。与正常组织相比，实体肿瘤组织在胞外表现出较低的pH值(6.8-7.2)，并且细胞中的内涵体/溶酶体表现出更低的pH值(5.0-6.5)。因此，利用微酸不稳定化学键如缩醛、缩酮和原酸酯来制备纳米凝胶以实现酸响应性的药物释放有望成为治疗癌症的一种有效途径。与缩醛、缩酮相比，基于原酸酯的酸敏感纳米药物载体在微酸环境中具有更高的敏感性，并且药物从基于原酸酯的纳米载体中释放行为可被其所处的pH环境进行调控。此外，基于原酸酯的纳米药物载体还具有一些其他优越特性，如良好的生物相容性和在中性环境中较高的稳定性。因此，选择原酸酯制备pH敏感的纳米凝胶是一种潜在的优越途径。
　　综上所述，本文设计、制备了一种新型酸敏感的壳聚糖纳米凝胶药物载体，并对其体内外抗肿瘤作用进行了评价:
　　(1)新型酸敏感交联剂和改性壳聚糖的合成:首先，基于本课题组以前报道过的二氨基原酸酯单体与甲基丙烯酸酐反应得到新型的酸敏感交联剂N'，N-{2-[2-甲氧基-[1，3]二氧戊环-4-亚甲基氧）]-乙基}-2-甲基丙烯酰胺(OEAM)，并通过核磁氢谱、碳谱、质谱以及元素分析确定其结构;其次，通过丁二酸酐与壳聚糖反应制备丁二酰化壳聚糖(SCS)，采用红外分析和XRD衍射分析确定其结构;最后，通过甲基丙烯酸酯化的策略将SCS进行功能化，得到甲基丙烯酸酯化的丁二酰化壳聚糖(MASCS)，通过核磁氢谱分析确定其结构。
　　(2)酸敏感的壳聚糖纳米凝胶的制备:以MASCS为大分子单体，OEAM作为交联剂，在水溶液中通过自由基共聚的方法制备酸敏感的壳聚糖纳米凝胶。纳米凝胶的粒径以及光散射强度采用马尔文粒径仪来进行测试。此外，通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察纳米凝胶的形貌特征。
　　(3)酸敏感的壳聚糖纳米凝胶的体外表征:选择阿霉素(DOX)作为抗肿瘤药物模型，并负载到纳米凝胶中，壳聚糖纳米凝胶的载药量为16.5％。酸敏感性原酸酯交联剂制备的纳米凝胶表现出酸诱导性降解和药物释放行为。MTT结果表明，未负载DOX的纳米凝胶具有良好的生物相容性和安全性，负载DOX的纳米凝胶表现出药物剂量依赖性的细胞毒性。体外细胞摄取实验表明，负载药物的纳米凝胶能够有效地被2D细胞和3-D细胞摄取，并且表现出良好的肿瘤细胞抑制性。
　　(4)壳聚糖纳米凝胶的体内表征:体内药物分布和抗肿瘤效果采用肝癌H22荷瘤小鼠模型进行评估。体内药物分布和抗肿瘤结果表明，酸敏感的壳聚糖纳米凝胶能有效延长DOX在血液中的循环时间，提高DOX在肿瘤组织中的浓度，表现出最好的抗肿瘤效果。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 抗肿瘤药物分类

1．2．1 小分子药物

1．2．2 生物大分子药物

1．3 纳米药物载体

1．4 纳米凝胶

1．5 常用的纳米凝胶材料

1．5．1 合成高分子材料

1．5．2 天然高分子材料

1．6 纳米凝胶的制备方法

1．6．1 纳米凝胶的自组装法

1．6．2 纳米凝胶的单体聚合法

1．6．3 纳米凝胶的化学交联法

1．7 智能响应性纳米凝胶

1．7．1 pH响应性纳米凝胶

1．7．2 温度响应性纳米凝胶

1．7．3 氧化还原性纳米凝胶

1．8 纳米凝胶的应用

1．9 论文的选题及主要内容

第二章 新型酸敏感交联剂和改性壳聚糖的合成

2．1 引言

2．2 实验试剂与仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 甲基丙烯酰胺类原酸酯单体(OEAM)的合成

2．3．2 丁二酰化壳聚糖(SCS)的合成

2．3．3 甲基丙烯酰胺化的丁二酰化壳聚糖(MASCS)的合成

2．4 合成产物的表征

2．4．1 OEAM的核磁共振表征

2．4．2 OEAM的质谱表征

2．4．3 OEAM的元素分析表征

2．4．4 SCS的红外光谱表征

2．4．5 SCS的X射线衍射表征

2．4．6 SCS的羧化程度

2．4．7 MASCS的核磁共振氢谱表征

2．5 结果与讨论

2．5．1 OEAM的核磁共振谱图分析

2．5．2 OEAM的质谱分析

2．5．3 OEAM的元素分析结果

2．5．4 SCS的红外光谱分析

2．5．5 SCS的X射线衍射分析

2．5．6 SCS的羧化程度分析

2．5．7 MASCS的核磁共振氢谱分析

2．6 本章小结

第三章 酸敏感的壳聚糖纳米凝胶的制备与表征

3．1 引言

3．2 实验试剂和仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 纳米凝胶的制备

3．3．2 粒径分布及电荷表征

3．3．3 纳米凝胶的组成

3．3．4 纳米凝胶的形貌观察

3．3．5 pH敏感性考察

3．4 结果与讨论

3．4．1 纳米凝胶的制备

3．4．2 粒径分布和电位表征

3．4．3 纳米凝胶的组成

3．4．4 纳米凝胶的形貌观察

3．4．5 pH敏感性考察

3．5 本章小结

第四章 酸敏感的壳聚糖纳米凝胶的载药及体外表征

4．1 引言

4．2 实验试剂和仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 不同pH缓冲溶液的配置

4．3．2 阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)的标准曲线绘制

4．3．3 负载DOX的纳米凝胶的制备

4．3．4 负载DOX的纳米凝胶的稳定性

4．3．5 载药纳米凝胶的体外药物释放

4．3．6 细胞培养

4．3．7 纳米凝胶的体外细胞毒性

4．3．8 纳米凝胶降解产物的体外细胞毒性

4．3．9 负载DOX的纳米凝胶的细胞毒性

4．3．10 纳米凝胶在2D细胞模型中的摄取

4．3．11 流式分析

4．3．12 SH-SY5Y 3-D细胞的培养

4．3．13 负载DOX的纳米凝胶在3-D细胞中的渗透

4．3．14 负载DOX的纳米凝胶在3-D细胞中的毒性

4．4 结果与讨论

4．4．1 负载DOX的纳米凝胶的制备

4．4．2 负载DOX的纳米凝胶的稳定性

4．4．3 载药纳米凝胶的体外药物释放

4．4．4 纳米凝胶的细胞毒性

4．4．5 纳米凝胶在2D细胞模型中的摄取

4．4．6 负载DOX的纳米凝胶在3-D细胞中的渗透

4．4．7 负载DOX的纳米凝胶在3-D细胞中的毒性

4．5 本章小结

第五章 酸敏感的载药壳聚糖纳米凝胶的体内抗肿瘤

5．1 引言

5．2 实验试剂和仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验仪器

5．3 实验方法

5．3．1 小鼠肿瘤模型的建立

5．3．2 药物在小鼠体内的分布

5．3．3 小鼠体内抗肿瘤效果

5．3．4 小鼠组织学分析

5．3．5 统计学分析

5．4 结果与讨论

5．4．1 药物在小鼠体内的分布

5．4．3 小鼠体内抗肿瘤效果

5．4．4 小鼠组织学分析

5．5 本章小结

结论

参考文献

致谢

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